獸醫實驗室熒光RT-PCR質量控制

摘要：近年，隨著實驗室熒光RT-PCR檢測方法的推廣應用，很多基層地區的獸醫實驗室和檢測機構并不能控制整體的檢測質量，影響最終的檢測結果。該文主要結合實際工作經驗，重點分析獸醫實驗室熒光RT-PCR檢測的質量控制措施，希望通過該次研究對提高病原微生物實驗室診斷準確性、精確性有一定幫助。

關鍵詞：獸醫實驗室;熒光RT-PCR檢測法;質量控制措施

中圖分類號：S851.7 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.16.043

0 引言

獸醫實驗室熒光RT-PCR又被稱為反轉路聚合酶鏈反應，該種檢測技術主要是將RNA的反轉錄技術和cDNA的聚合酶鏈式擴增技術有效結合，具有檢測精確度高、特異性強、重復性好的特點，已被廣泛應用于多種病毒的實驗室診斷。熒光RT-PCR檢測是一項技術要求很高的工作，在操作中，極微量的污染物污染藥品都會導致假陽性假陰性的產生，最終影響檢測結果。實驗室布局不合理、人員培訓不到位、實驗室質量管理意識薄弱等問題也會影響檢測結果。因此，需要加強管理，降低各種影響因素。

1 實驗室人員管理

熒光RT-PCR檢測法是一種成熟的病原微生物檢測方法，被廣泛應用于多種病毒的實驗室診斷。在具體操作中，實驗室人員的熟練程度和責任心直接影響檢測結果的準確性。由于該種檢測技術的靈敏度很高，在操作中一定要保證細致化，避免因為不細致的操作導致反應體系比例不一致，甚至造成病料交叉污染。在工作開展中，對于檢測中出現的問題，要求檢測人員從自身尋找原因。實驗室內部應該實行考核上崗和定期培訓制度，只有獲得相應考核資格證書的人員，才能進入實驗室開展檢測。在操作中，檢驗人員要嚴格按照相關質量規程體系，分步驟操作，明確最佳的檢測方法，注重實驗中的每一個細節質量控制。實驗室應該定期對相應的技術人員進行質量考核，組織同級別的或更高級別的實驗室開展對比實驗，以此提升實驗室檢測人員的專業能力和責任心。

2 儀器設備管理

熒光RT-PCR檢測法應用中通常會涉及多種儀器和藥品，常用儀器主要包括熒光RT-PCR擴增儀、生物安全柜、離心管、離心機、核算提取儀、移液器等，針對這些儀器設備，在操作中一定要嚴格按照相關規程，定期的維護和檢查。必要時還應該對相應的稱量儀器設備進行校對，保證其稱量的準確性。對于檢測中使用頻率較高的熒光RT-PCR擴增儀，應該在制造廠商的配合下，每半年校對1次，并做好校對儀器設備的標志工作[1]。核酸產物在上機前，應該做好封膜處理，避免內容物反應或者蒸發液泄漏污染儀器。

3 藥品器材管理

檢測工作開展中，各項藥品和試劑的質量直接影響最終的檢測結果，因此在各項試劑和藥品購買中，必須保證購進途徑的官方統一，避免選擇假冒偽劣或過期的試劑。器械設備在使用前，都需要進行嚴格的清洗和衛生消毒，一次性設備在使用后應該進行嚴格的無害化處理。實驗室配置好的試劑，應該使用無菌的容器分裝，或者在使用前對容器進行高壓滅菌處理。此外，PCR試劑反應液應該與樣品以及PCR產物分開保存，不能將其放置在同一個保存容器中，需要低溫保存，經常使用的試劑，可以分裝儲存，避免反復融凍影響試劑質量。在實驗室內部應該配置專用的工作服裝、工作鞋帽和辦公用品。為保障不同功能區域的清潔衛生，個體的防護設備和用品不能混合使用，需要構建物品使用管理制度。

4 檢測質量控制

熒光RT-PCR檢測工作開展中，要求動物實驗室構建完善的技術標準和操作規程，并明確檢測中的注意事項，要求檢驗人員嚴格按照操作規程的要求和相關規定內容，準確采樣，準確稱量，準確制樣，妥善保存核酸提取物，然后開展擴增操作、產物檢測。實驗室內部的檢測方法應該按照國際標準、國家標準、區域標準、行業標準的方式選擇。需要實驗室自制標準時，要進行嚴格的檢測檢驗，確保合格后才能使用。此外，在檢測中所采用的各種方法都應該受到質量管理控制。

5 環境管理

5.1功能劃分

在實驗室的內部應該將其劃分為試劑儲存區域、準備區域、樣品處理區域、基因擴增區域和產物分析區域。如果實驗室內置配置熒光PCR儀，則擴增區域和產物分析區域可以合并。各個功能區域間應該按照上述順序進行妥善的劃分，并保證整個操作單向流動，形成一個單向的保護屏障，避免不同區域之間的實驗產生相互干擾，造成樣品污染，影響最終的檢測結果。

5.2室內環境控制

在整個實驗前后，需要使用紫外線燈對整個實驗區域進行嚴格的照射消毒，每次照射消毒時間不得低于30min，能有效破壞殘留在檢測環境中的RNA。紫外線消毒結束后，選擇使用10%次氯酸鈉溶液或1%過氧乙酸溶液，對整個地面和工作臺面進行嚴格的清洗和衛生消毒。實驗室內的樣本和擴增產物是氣溶膠的主要污染源，因此要保證實驗室經常性的換氣消毒。實驗結束后所使用的一次性設備，應該嚴格的無害化處理，各種廢棄的反應試管和槍頭應該放置于1mo1/L稀鹽酸中浸泡處理[2]，泡時間不能低于6h。各種廢棄物必須進行高壓滅菌處理，按照醫療垃圾進行無害化處理，防止對周圍環境造成污染。

6 檢測過程質量控制

6.1核酸提取

熒光RT-PCR檢測工作開展中，RNA的提取質量直接決定著檢測結果的正確性和靈敏度。在實驗操作中一定要嚴格按照試劑盒的相關要求，在二級生物安全柜內操作，每一步驟應該認真仔細，避免各項試劑被污染，避免樣本之間相互交叉污染。在開關EP管時，要注意手的任何部位都不能觸及試管口和內部。樣品添加時應該進行陰性對照添加，首先加樣，然后再添加低濃度的樣品，最后添加陽性對照。不能手動混勻樣品或者使用移液器混合樣品，要使用指定的儀器震蕩混合。

6.2擴增

在擴增操作中，檢測人員必須按照儀器設備的使用規程進行上機操作，保障各個試管平衡擺放。對于PCR管加蓋平蓋或者光膜時，不能用手直接觸碰，更不能使用記號筆標記[3]。通常大多數儀器設備都會自動扣除本底給出擴增曲線，對于個別因為各種原因導致的失真，在判定中應該將其排除。

7 結束語

RT-PCR檢測方法對技術人員的要求較高，任何一個細小的疏忽都有可能造成假陽性和假陰性，導致檢測結果不能反映真實的病毒感染情況，因此在實驗室診斷中，特殊檢測人員在檢測中不斷加強自身專業素質提升，在操作中認真細致，嚴格按照實驗室的操作規程開展實驗，保證檢測結果的準確性、精確性。

參考文獻

[1]劉賀.熒光RT-PCR準確性的影響因素及控制策略[J].中國動物檢疫，2013，30（11）：26-28.

[2]劉賀.獸醫實驗室RT-PCR的質量控制[J].動物醫學進展，2013，34（10）：115-117.

[3]蘭玲，王濤.熒光RT-PCR與普通RT-PCR檢測技術的比較[J].新疆畜牧業，2012（3）：34-35.

作者簡介：黃美芝（1983-），女，壯族，獸醫師，本科，主要從事實驗室檢測方面的工作。