p-ERK 在復發性鼻息肉組織中的表達意義

劉曉華 魏永佳 陳麗麗

鼻息肉是一種常見病，其發病率及復發率均較高，目前治療最有效的方法為鼻內鏡手術加糖皮質激素治療，但是治療后仍有20%左右復發，是鼻科目前治療的難點[1]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是細胞內的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。研究證實，MAPK信號轉導通路存在于多數細胞內，將細胞外刺激信號轉導至細胞內及其核內，并引起細胞生物學反應，在這個過程中起著重要的作用[2]。本研究主要應用蛋白質免疫印記技術及間接免疫熒光技術，以此來檢測磷酸化細胞外信號調節激酶2（Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK2）在鼻息肉（nasal polyp，NP）組織中的表達位置及程度，根據實驗結果來分析p-ERK2在鼻息肉的發生發展中的作用，觀察其與鼻息肉復發是否存在關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗所需標本均取自2018年1月—2018年6月于黑龍江省醫院耳鼻喉科行鼻內鏡手術的患者，下鼻甲正常鼻黏膜組織為對照組20例（男12例，女8例）患者年齡最大55歲，最小28歲，平均年齡（41.2±13.1）歲；鼻息肉組選伴有息肉的慢性鼻竇炎患者31例（男17例，女14例），患者年齡最大65歲，最小29歲，平均年齡（47.5±18.1）歲；復發性鼻息肉組患者都兩次以上鼻息肉手術史患者23例（男14例，女9例），患者年齡最大63歲，最小33歲，平均年齡（48.7±15.3）歲。三組患者均排除后鼻孔息肉、哮喘、過敏性鼻炎，均排除嚴重的其他系統疾病；均于術中采集標本，術后經病理科證實。所有患者取材前均簽訂黑龍江省醫院批準的知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑來源 主要試劑及來源PVDF膜、兔抗人p-ERK2單克隆抗體購自Abcam公司（美國），SP試劑盒購自福州邁新公司（中國）。

1.2.2 實驗方法

Westernblotting變性（100 ℃，3 min）后每泳道加樣50 mg，SDS-PAGE凝膠電泳（90 V，2 h），轉膜（90 V，1.5 h）后封閉，先后加入一抗（1 mg/mL）、二抗（1:200），水平搖床室溫孵育各1.5 h，顯色、曝光及拍照。

1.2.3 免疫熒光檢測

（1）冰凍切片3 μm，室溫放置30 min后，入4 ℃丙酮固定10 min，PBS洗5 min×3次。用3%過氧化氫孵育5min，消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗5 min×2次;（2）0.01 M PBS（pH 7.2 ～ 7.4）浸洗30min；（3）1% BSA-PBS封閉30 min；（4）傾去，分別加1∶30稀釋的兩支一抗，置濕盒中4 ℃過夜；（5）次日拿出濕盒，棄一抗，0.01 M PBS（pH 7.2 ～ 7.4）沖洗，3 min×3次；（6）滴加1:100稀釋的對應的熒光標記二抗（1% BSA-PBS稀釋），37℃孵育30 min；（7）棄二抗，0.01 MPBS（pH 7.2 ～ 7.4）；（8）DAPI進行細胞核復染20 min，PBS沖洗3 min，重復3次；（9）0.5 M Na2CO3-50%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并取片；（10）在激光共聚焦顯微鏡下,每張切片隨機選取5個高倍鏡視野（400倍），然后利用圖像分析軟件計算熒光度平均值。

1.3 觀察指標

集齊全部的標本懸液之后，可開始刺激、培養，進行細胞膜打孔，熒光抗體進行染色標記，通過Western blot及免疫熒光法檢測p-ERK2表達情況的差異。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0統計分析軟件進行數據處理，計量資料采用表示，符合正態分布的數據組間比較采用t 檢驗，多組計量資料采用方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 WB 檢測 p-ERK2 的表達結果

Western blotting p-ERK2在正常鼻黏膜組織和鼻息肉組及復發性鼻息肉組的表達有統計學差異，見表1。

2.2 熒光強度值p-ERK2的表達結果

熒光強度值p-ERK2在正常鼻黏膜組織和鼻息肉組及復發性鼻息肉組的表達有統計學差異，見表2。

3 討論

現有研究表明，多種炎癥因子的表達和嗜酸性粒細胞的作用是鼻息肉發生的重要環節。隨著免疫學和分子生物學等學科的發展，目前發現的參與鼻息肉病理過程的化學介質多達數十種甚至上百種，其中的細胞因子倍受重視[3]。細胞因子是由機體的免疫細胞和非免疫細胞合成和分泌，其具有較強的生物活性，并且廣泛的存在于鼻息肉的微環境中。哺乳類細胞目前發現存在著下述三條MAPK信號通路，ERK信號通路是最經典的MAPK信號轉導通路，廣泛存在于真核細胞內，ERK 1/2 是ERK信號通路的重要下游元件，并且研究發現ERK2是在呼吸道黏膜的主要亞型。ERK2據目前所知有2種形式，激活型及失活型，當被激活時，p-ERK2會進入胞核引起一系列的細胞反應。本研究結果顯示：正常鼻黏膜組中p-ERK2主要表達在腺上皮細胞和炎癥細胞的細胞核。鼻息肉組和復發性鼻息肉組：p-ERK2主要表達在增生的上皮細胞、腺上皮細胞、炎癥細胞的細胞核。三組結果有統計學差異（P＜0.05），結合其他學者的研究，可推斷p-ERK2的主要作用機制如下：（1）ERK 信號通路的激活促進了黏膜內淋巴細胞的大量增殖、分化及遷移；（2）ERK 信號通路激活 IL-5 和嗜酸性粒細胞趨化因子受體進而激活嗜酸性粒細胞促使其脫顆粒；（3）ERK信號通路通過誘導Ig-E 抗體的產生，致氣道發生變應性炎癥；（4）ERK 信號通路促使T細胞、肥大細胞、支氣管上皮細胞等Ig-E 介導的趨化因子、半胱氨酸白三烯及細胞因子釋放；（5）ERK信號通路持續激活發揮抗細胞凋亡的作用，導致呼吸道上皮細胞正常的新陳代謝打亂，導致屏障功能下降[4-7]。ERK2調控細胞的生長與凋亡，p-ERK2 表達升高可能會產生抗細胞凋亡的作用[8-12]，可能導致使鼻黏膜上皮細胞過度增殖，逐漸形成息肉樣增生。p-ERK2還表達在鼻息肉的嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等，可以推測ERK 信號通路的激活與鼻息肉的發展相關。鼻息肉組織中，p-ERK2表達量明顯升高，在復發性鼻息中， p-ERK2表達進一步升高，在息肉組織增生的上皮細胞、黏膜下炎癥細胞以及腺上皮細胞的細胞核內，其在復發性鼻息肉組中表達更加明顯。本實驗采用兩種方法檢測，因為免疫組化只能顯示目的蛋白的定位， Western-blot檢測可以測定目的蛋白的分子量。在定位和分子量都正確的情況下，整個實驗數據的準確性會更高一點，不容易受假陽性的干擾。

表1 WB 檢測p-ERK2 在正常鼻黏膜、鼻息肉、復發性鼻息肉組織的表達結果（ ，pg/mL）

表1 WB 檢測p-ERK2 在正常鼻黏膜、鼻息肉、復發性鼻息肉組織的表達結果（ ，pg/mL）

注：與正常組比較，*t=3.504，**t=3.244，P ＜0.05

分組 例數 p-ERK2正常鼻黏膜組 20 0.402±0.142鼻息肉組 31 0.593±0.215*復發性鼻息肉組 23 0.621±0.271**F 值 - 6.410 P 值 - ＜0.005

表2 免疫熒光hf 檢測p-ERK2 在正常鼻黏膜、鼻息肉、復發性鼻息肉組織的表達結果

表2 免疫熒光hf 檢測p-ERK2 在正常鼻黏膜、鼻息肉、復發性鼻息肉組織的表達結果

注：與正常組比較，*t=5.170，**t=8.056，P ＜0.05

分組 例數 p-ERK2正常鼻黏膜組 20 733.6±119.3鼻息肉組 31 1 017.8±129.4*復發性鼻息肉組 23 1 187.5±225.8**F 值 - 41.880 P 值 - ＜0.05

綜上所述，p-ERK2 表達量明顯升高與鼻息肉的發生與復發相關。抑制p-ERK2的激活可能為臨床工作中治療鼻息肉提供新的思路和方向。