補陽還五湯對大鼠全腦缺血再灌注L型Ca2+通道平均開放時間的影響

梁逸仙　周光輝　廖仲波　趙青　周銳鈞　張繼平　秦曼妮

[摘要] 目的 探討補陽還五湯對大鼠全腦缺血再灌注L型Ca2+通道平均開放時間的影響。 方法 應(yīng)用四血管閉塞法制備全腦缺血再灌注大鼠62只，采用隨機數(shù)字表法將其分為對照組和研究組，每組各31只。對照組應(yīng)用生理鹽水灌服，研究組應(yīng)用補陽還五湯水煎液灌服。在處理后2、12、24、48、72 h五個時間點進行觀察。比較兩組大鼠不同時間點L型Ca2+通道平均開放時間、腦組織含水量、血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。 結(jié)果 研究組大鼠不同時間點L型Ca2+通道平均開放時間明顯短于對照組（P < 0.05）;與本組再灌注72 h比較，兩組其余各時間點L型Ca2+通道平均開放時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。缺血再灌注處理后研究組大鼠腦組織含水量也明顯低于對照組（P < 0.05），與本組再灌注72 h比較，兩組其余各時間點腦組織含水量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。干預(yù)后，研究組血清SOD活性高于對照組，而MDA含量低于對照組（P < 0.05）。 結(jié)論 補陽還五湯對大鼠全腦缺血再灌注損傷具有一定治療作用，其作用與縮短不同時間點L型Ca2+通道平均開放時間、降低大鼠腦組織含水量、增高大鼠血清SOD活性及降低MAD含量有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 補陽還五湯;大鼠全腦缺血;再灌注;L型Ca2+通道;藥效研究

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）06（a）-0013-04

Effects of Buyang Huanwu Decoction on the average opening time of L-type Ca2+ channel in rats with global cerebral ischemia-reperfusion

LIANG Yixian1? ?ZHOU Guanghui1? ?LIAO Zhongbo1? ?ZHAO Qing1? ?RUI Jun1? ?ZHANG Jiping2? ?QIN Manni1

1.Department of Clinical Laboratory， Dongguan Third People′s Hospital， Guangdong Province， Dongguan? ?523326， China; 2.Department of Rehabilitation Medicine， Foshan Hospital Affiliated to Southern Medical University， Guangdong Province， Foshan? ?528000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Buyang Huanwu Decoction on the average opening time of L-type Ca2+ channel in rats with global cerebral ischemia-reperfusion. Methods Sixty-two rats with global cerebral ischemia-reperfusion were prepared by four-vessel occlusion method. They were divided into control group and research group by random number table method， with 31 rats in each group. The control group was fed with normal saline， while the research group was fed with Buyang Huanwu Decoction. After 2， 12， 24， 48 and 72 h of treatment， the rats were observed. The average opening time of L-type Ca2+ channel， brain water content， serum superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） levels were compared between the two groups at different time points. Results The average opening time of L-type Ca2+ channels in the study group was significantly shorter than that in the control group （P < 0.05）. Compared with 72 h after reperfusion， the average opening time of L-type Ca2+ channels in the two groups at different time points were statistically significant （P < 0.05）. After ischemia-reperfusion treatment， the water content in the study group was also significantly lower than that in the control group （P < 0.05）. Compared with 72 h after reperfusion， the brain water content in the other time points of the two groups were significant difference （P < 0.05）. After intervention， serum SOD activity of the study group was higher than that of the control group and the MDA content was lower than that of the control group （P < 0.05）. Conclusion Buyang Huanwu Decoction has a certain therapeutic effect on global cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Its effect is related to shortening the average opening time of L-type Ca2+ channel at different time points， decreasing the brain water content of rat， increasing the activity of serum SOD and decreasing the content of MAD in rat.

[Key words] Buyang Huanwu Decoction; Rat global cerebral ischemia; Reperfusion; L-type Ca2+ channel; Pharmacodynamic study

隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展，腦血管疾病嚴重危害著人類的健康。在對腦缺血再灌注后，腦組織損傷程度會因迅速的增劇現(xiàn)象加重腦組織細胞的損傷程度，但是恢復(fù)腦神經(jīng)功能的基礎(chǔ)就是對腦組織再灌注，故保護腦細胞功能需要消除再灌注損傷。由于顱內(nèi)的缺血問題以及缺氧問題導(dǎo)致的腦梗死是臨床上主要的腦血管疾病之一，會影響患者的神經(jīng)功能，因其發(fā)病率及致殘率高而受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，部分腦梗死患者會出現(xiàn)血管以及神經(jīng)元的損傷，從而出現(xiàn)生活方面的障礙[1]。補陽還五湯是良好的治療腦缺血藥物之一，其具有活血化瘀通絡(luò)的作用，現(xiàn)在常用于治療泌尿系統(tǒng)疾病以及心腦血管疾病。傳統(tǒng)治療主要使用抗凝、溶栓、抗血小板聚集以及促進側(cè)支循環(huán)等干預(yù)措施，雖然能夠改善患者癥狀，但對恢復(fù)患者的生活質(zhì)量效果不夠理想。全腦缺氧后想要快速恢復(fù)大腦相關(guān)功能，為盡可能減少損傷，實施再灌注是一項非常有效的治療措施，廣東省東莞市第三人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）在腦缺血患者治療的同時，聯(lián)合使用補陽還五湯，取得了明顯效果，現(xiàn)采用大鼠制備全腦缺血模型，探討其作用機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

選取SD大鼠90只，體重280～350 g，1～3月齡，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0020;SPF級環(huán)境由廣州中醫(yī)藥大學(xué)（大學(xué)城）實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0085。

1.2 方法

補陽還五湯原方：黃芪120 g、歸尾6 g、赤芍4.5 g，紅花、桃仁、川芎、地龍各3 g，本研究用原方中藥材的3倍量，并加入8倍水，煎煮2次，≥2 h/次，濾除藥渣，所得濾液保留，過夜處理，然后再過濾，制成補陽還五湯含藥1 g/mL。

應(yīng)用四血管閉塞法復(fù)制全腦缺血模型，建立大鼠全腦缺血再灌注模型成功的指標(biāo)包括：①大鼠某些反射消失，包括對光反射、翻正反射等[2];②角膜反射不敏感甚至消失;③仍可出現(xiàn)睫毛反射;④將雙側(cè)的頸動脈作夾閉處理，約1 min內(nèi)大鼠的意識出現(xiàn)障礙[3];⑤大鼠自主呼吸速度增加;⑥毛發(fā)豎立;⑦小便不受意識控制[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：在再灌注期間大鼠出現(xiàn)全身痙攣甚至死亡。采用隨機數(shù)字表法將造模成功的動物分為對照組（n = 31）和觀察組（n = 31），對照組采用2 mL/100 g蒸餾水灌服，1次/d;觀察組應(yīng)用補陽還五湯2 mL/100 g灌服，1次/d，兩組大鼠均連續(xù)用藥2周，給藥結(jié)束2 h后復(fù)制模型[5]，在缺血再灌注后2、12、24、48、72 h五個時間點取材，并進行指標(biāo)檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組大鼠不同時間點L型Ca2+通道平均開放時間、腦組織含水量、大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。應(yīng)用經(jīng)典干濕重法測定腦組織含水量，計算公式：腦組織含水量（%）=（濕腦重量-干腦重量）/濕腦重量×100%。實驗方法及含量測定按試劑盒說明進行蛋白定量，即按lowry法測定腦組織中SOD和MDA含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠不同時間點L型Ca2+通道平均開放時間比較

研究組大鼠再灌注2、12、24、48、72 h L型Ca2+通道平均開放時間明顯低于對照組（P < 0.05）。與本組再灌注72 h比較，兩組其余各時間點L型Ca2+通道平均開放時間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 兩組大鼠再灌注腦組織含水量比較

研究組大鼠再灌注2、12、24、48、72 h腦組織含水量明顯低于對照組大鼠（P < 0.05）。與本組再灌注72 h比較，兩組其余各時間點腦組織含水量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 兩組大鼠干預(yù)前后血清SOD活性、MDA含量比較

兩組大鼠干預(yù)前血清SOD活性、MDA含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）;干預(yù)后，研究組大鼠血清SOD活性明顯高于對照組（P < 0.05），但MDA含量明顯低于對照組（P < 0.05）。見表3。

3 討論

腦缺血損傷在臨床上具有極高的發(fā)病率以及死亡率，主要表現(xiàn)為腦循環(huán)血量下降，大多數(shù)出現(xiàn)腦缺血損傷的患者都會出現(xiàn)運動行為障礙以及認知功能障礙，對其生活質(zhì)量影響重大。誘發(fā)全腦缺血的因素很多，臨床研究中發(fā)現(xiàn)Ⅲ型主動脈弓是全腦血管造影致血栓栓塞的臨床危險因素，患者弓上動脈與主動脈弓之間夾角小、開口處位置較低，增加了腦缺血發(fā)生概率[6];另外，空腹血糖也是重要危險因素之一，血糖存在促進血液凝固及控制纖溶反應(yīng)等作用，其能讓血液出現(xiàn)高凝狀態(tài)。此外，高血糖加快血紅蛋白糖基轉(zhuǎn)變，使組織缺少氧氣造成代謝異常，損害血管內(nèi)皮細胞，血栓形成速度加快[7];臨床操作中經(jīng)常發(fā)生因?qū)Ыz或?qū)Ч茉诘竭_目標(biāo)血管時，與硬化斑塊血管壁碰撞導(dǎo)致斑塊堵塞遠端血管，也就是說，目標(biāo)血管內(nèi)斑塊越多，腦缺血率越高。補陽還五湯屬于中藥方劑，主要功效能夠活血通絡(luò)，對治療腦缺血的意義十分重大[8]。腦缺血損傷中一般存在兩種細胞損傷機制：一種是在缺血早期時段內(nèi)神經(jīng)細胞發(fā)生水腫以及壞死的情況，另一種是在缺血再灌注2～7 d內(nèi)遲發(fā)性神經(jīng)元受到損傷，以及神經(jīng)細胞壞死，腦缺血再灌注以后會產(chǎn)生大量的炎性因子以及細胞凋亡因子，使腦細胞的損傷程度進一步增加。年齡是腦栓塞重要因素之一，患者因年齡增長，左心房擴大，左心室血流速度減慢，臨床研究發(fā)現(xiàn)栓塞患者均為年齡>75歲的老年患者，其中女性患者占很大一部分，其原因可能是女性患者分泌激素較低或激素分泌紊亂所致[9]。

CD62p以及CD63都會刺激PAF的合成，使炎性反應(yīng)發(fā)生惡性循環(huán)，也會使血小管的活性進一步增加阻斷新的血管，使神經(jīng)元由于腦缺血的損害進一步增加，導(dǎo)致腦血管進一步發(fā)生病變，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后觀察組大鼠血清SOD活性高于對照組，但MDA含量低于對照組，全腦缺血后再灌注會使神經(jīng)細胞出現(xiàn)損傷，自由基所發(fā)生的一連串的系列反應(yīng)使得細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，被破壞的部位主要是生物體中的膜結(jié)構(gòu)，其中的磷脂不飽和脂肪酸發(fā)生系列反應(yīng)，最終得到的是脂質(zhì)類的過氧化物MDA。缺血再灌注并且經(jīng)處理后研究組大鼠不同時間點L型Ca2+通道平均開放時間明顯短于對照組大鼠（P < 0.05），而生物體中清除自由基的最重要的物質(zhì)就是SOD，這種物質(zhì)在大多數(shù)的生物體內(nèi)廣泛存在，屬于一種金屬性質(zhì)的酶，能夠?qū)Τ蹶庪x子自由基實施具有選擇性及針對性的清除，使得超氧自由基的特殊作用即氧化作用收到不同程度的壓制[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后研究組大鼠血清SOD活性明顯高于對照組，但MDA含量則明顯低于對照組（P < 0.05），提示補陽還五湯能使大鼠SOD活性顯著增高，而MAD含量降低，從而有助于改善全腦缺血缺氧。

神經(jīng)細胞中導(dǎo)致缺血性腦損傷的一個不可忽視的因素就是Ca2+的代謝失調(diào)。全腦缺血再灌注會導(dǎo)致生物體內(nèi)Ca2+的代謝受到影響，細胞內(nèi)外Ca2+的穩(wěn)定對于生物體來說具有十分重大的意義，因此全腦缺血再灌注后生物體內(nèi)Ca2+的代謝受到廣泛的關(guān)注[11]。本研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注并且經(jīng)處理后研究組大鼠不同時間點L型Ca2+通道平均開放時間明顯短于對照組，提示補陽還五湯對維持細胞內(nèi)外Ca2+的代謝穩(wěn)定具有一定作用[12]。

中醫(yī)理論將腦缺血歸屬于“中風(fēng)”這一范疇，患者往往是因為年老體弱、臟腑功能出現(xiàn)失調(diào)而使得瘀血內(nèi)生，最終出現(xiàn)腦脈痹阻[13-14]。因此，在該病的治療過程當(dāng)中，中醫(yī)強調(diào)同治痰瘀。從痰瘀阻絡(luò)的病因病機出發(fā)，使用化痰通絡(luò)藥，主要目的在于通絡(luò)祛風(fēng)以及化痰通腑[15]。補陽還五湯，顧名思義，就是指此種湯藥能夠帶給服用之人充足的陽氣。現(xiàn)代研究[16]發(fā)現(xiàn)，方中黃芪、赤芍、紅花、桃仁、川芎、地龍、歸尾聯(lián)用，相輔相成，能夠活血化瘀、補氣養(yǎng)血，使得自由基對神經(jīng)細胞的損傷程度大大下降，生物體中的微循環(huán)以及某些部位如心肌的缺氧狀況得以改善。本研究采用的大鼠全腦缺血再灌注模型與人腦半球缺血性梗死極度的接近，與臨床患者的病情高度接近，實驗效果良好[17]。一氧化氮散布在中樞神經(jīng)的各個腦區(qū)，其在大腦內(nèi)具有多種作用，例如調(diào)節(jié)腦血流、參與突觸可塑性、炎癥性損害以及神經(jīng)元興奮毒性等，在腦缺血初期對細胞具有明顯的保護作用[18]。隨著缺血再灌注時間的延長，一氧化氮含量會短暫性的增高，加重損害神經(jīng)細胞，表現(xiàn)出神經(jīng)毒作用，經(jīng)實驗[19]表明腦缺血時的血漿濃度與腦水腫的程度、梗死灶大小等一致，在發(fā)生腦梗死時，其平衡將失控，舒縮血管比例失調(diào)是加重腦組織損傷的重要原因。本研究提示補陽還五湯能夠降低腦組織內(nèi)一氧化氮含量，提升腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)SOD的活性，使自由基對腦組織的傷害減輕，明顯減少缺血再灌注后腦梗死的面積以及腦組織含水量，對腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，其作用機制較為明顯[20]。

綜上所述，補陽還五湯在大鼠全腦缺血再灌注中的應(yīng)用效果明顯，對全腦缺血再灌注損傷有保護作用，能夠有效減小腦梗死的范圍，對大鼠的改善作用較為明顯，其作用機制與抗脂質(zhì)過氧化、降低血液黏度、抑制血小板活化以及防止鈣超載有很大關(guān)系。

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