二甲雙胍對變應(yīng)性鼻炎小鼠炎性狀態(tài)的影響

張國正，連 榮，苗文杰，余文發(fā)

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河南 衛(wèi)輝 453100)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是指機體在接觸特定變應(yīng)原以后由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，臨床表現(xiàn)多以鼻塞、流涕、噴嚏和鼻癢為主[1]。AR發(fā)病機制多認(rèn)為是由輔助性T細胞1(T-helper 1，Th1)/輔助性T細胞2(T-helper 2，Th2)免疫失衡紊亂導(dǎo)致，即Th2細胞過度極化及其相應(yīng)的炎性因子過度分泌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[2]。但有研究認(rèn)為，Th17細胞在AR的發(fā)病機制中具有重要作用，白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)作為Th17細胞分泌的主要細胞因子之一，對中性粒細胞和巨噬細胞在局部炎癥部位的募集具有強大的促進作用，從而導(dǎo)致局部慢性炎性狀態(tài)[3-4]。IL-17參與多種呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病，呂文漪等[5]研究認(rèn)為，IL-17在哮喘患者血清和痰液中的表達水平顯著升高，主要與呼吸道高反應(yīng)性的炎癥程度密切相關(guān)；劉春苗等[6]研究發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)原為塵螨的AR患者血清IL-17表達水平明顯升高，且與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。IL-17主要通過活化蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(janus protein tyrosine kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，而STAT3是JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中最為關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子之一，活性形式為磷酸化STAT3(phosphorylation of signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3)，其在AR患者鼻黏膜局部免疫調(diào)節(jié)中具有重要的生物學(xué)作用[7]。二甲雙胍是一種臨床廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病的降糖藥，但最近研究認(rèn)為，二甲雙胍可特異性抑制JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而降低IL-17表達[8-9]。結(jié)合上述文獻報道，考慮二甲雙胍對于AR具有潛在的治療作用，因此，本研究通過構(gòu)建卵清蛋白誘導(dǎo)的AR小鼠模型，觀察二甲雙胍對AR模型小鼠炎性狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡雄性無特定病原體級BALB/c小鼠30只，購自河南新鄉(xiāng)華蘭生物實驗動物中心[實驗動物合格證號：201801130025，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2015-0001]，體質(zhì)量18～20 g，在室溫(24±1) ℃及明、暗各12 h的條件下自由取食(高壓蒸汽滅菌用水及正常飼料喂養(yǎng))。

1.2 主要試劑與儀器二甲雙胍粉劑購自美國Sigma公司，抗IL-17兔抗、抗p-STAT3兔抗購自英國Abcam公司，鼠血清IL-17和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)檢測試劑盒購自美國R&D公司，鼠血清IL-6檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fsiher Scientific公司，Amersham Imager600凝膠系統(tǒng)成像儀購自日本GE Healthcare公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與處理將30只小鼠隨機分為對照組、模型組和二甲雙胍組，每組10只。將100 μg卵清蛋白聯(lián)合2 mg AL(OH)3溶于0.1 mL 生理鹽水中，造模的第1、3、5、7、9、11、13、15天對模型組和二甲雙胍組小鼠進行腹腔注射，每日1次，每次0.1 mL;第16天開始將500 μg卵清蛋白溶于10 μL生理鹽水中，對模型組和二甲雙胍組小鼠進行滴鼻，每鼻孔10 μL，每日1次，連續(xù)激發(fā)11 d。二甲雙胍組小鼠在造模同時每天給予150 g·L-1二甲雙胍溶液0.3 mL腹腔注射，連續(xù)25 d。對照組小鼠每日給予生理鹽水腹腔注射,每日1次，每次0.4 mL，連續(xù) 25 d；生理鹽水滴鼻，每日1次，每次10 μL，連續(xù)11 d。

1.3.2 各組小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α水平測定造模成功后，各組小鼠經(jīng)眼球取血2～5 mL，常溫下離心收集上層血清并置于-80 ℃冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清IL-17、IL-6和TNF-α水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 Western blot法檢測各組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3的表達造模成功后，眼球取血備用，采用斷頸法處死小鼠，并取鼻黏膜組織，置于高溫滅菌且經(jīng)液氮預(yù)冷后的研缽中，加入液氮研磨成粉末后移入1.5 mL的EP管，加入500 μL含苯甲基磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF)和蛋白酶抑制劑的放射免疫測定(radioimmuno-precipi-tation assay，RIPA)裂解液，冰上孵育約30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液至新的EP管進行分裝，-80 ℃冰箱中保存。配置上層和下層膠并插入梳子,待膠凝固后加入5 μL蛋白樣品和Marker，加樣進行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠，剪相應(yīng)大小的聚偏二氟乙烯膜，加入電轉(zhuǎn)液中進行電轉(zhuǎn)，牛奶封閉，加入一抗 IL-17(11 000)抗體、p-STAT3(11 000)抗體、β-actin (11 000) 4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(11 000)孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測目的條帶的灰度值，蛋白表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。所有實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α表達水平比較結(jié)果見表1。二甲雙胍組和模型組小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；二甲雙胍組小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組小鼠血清炎性因子水平比較

組別nIL-17/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)對照組1017.18±3.072.67±0.62133.98±5.34模型組1056.34±6.29a12.87±1.46a287.18±10.11a二甲雙胍組1036.72±2.55ab8.28±0.92ab248.54±20.65ab

注：與對照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

2.2 3組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3蛋白表達水平比較結(jié)果見圖1和表2。二甲雙胍組和模型組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3蛋白表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);二甲雙胍組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3蛋白表達水平顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1：模型組；2：二甲雙胍組；3：對照組。

圖1 3組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3蛋白的表達 (Western blot)

Fig.1 Expression of IL-17 and p-STAT3 protein in nasal mucosa of mice in the three groups (Western blot)

表2 3組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3蛋白表達比較

組別nIL-17p-STAT3對照組100.13±0.020.05±0.01模型組101.10±0.14a1.36±0.23a二甲雙胍組100.43±0.02ab0.28±0.01ab

注：與對照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

3 討論

二甲雙胍作為一種常用的雙胍類降糖藥已在臨床上使用多年，但最近多項研究認(rèn)為，二甲雙胍除了降糖作用外，還具有抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群、保護神經(jīng)功能、抑制角質(zhì)形成細胞及腫瘤細胞過度增殖等作用[8-12]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17能通過JAK/STAT信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)腫瘤細胞的局部浸潤轉(zhuǎn)移，IL-17也可激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidy-linositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路，促進炎性因子IL-6和TNF-α的釋放，而二甲雙胍可通過抑制JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制腫瘤細胞再生[8-9]。IL-17作為一種重要的炎性因子參與眾多變態(tài)反應(yīng)性疾病，宋輝等[13]研究發(fā)現(xiàn)，AR小鼠黏膜組織中IL-17 mRNA表達水平顯著升高，故而參考既往文獻報道結(jié)果[6,13]，作者認(rèn)為 IL-17的高表達在AR的發(fā)病機制中可能具有顯著作用，同時，關(guān)于二甲雙胍和AR相關(guān)性研究報道較少，因此，本研究采用卵清蛋白構(gòu)建AR小鼠模型，探討二甲雙胍干預(yù)對AR小鼠炎性狀態(tài)的影響。

前期預(yù)實驗結(jié)果表明，僅150 g·L-1二甲雙胍溶液0.3 mL腹腔注射時，3組小鼠血糖水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，本研究最終選擇 150 g·L-1二甲雙胍進行干預(yù)處理。本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和 p-STAT3 蛋白表達水平顯著低于模型組，但高于對照組；提示二甲雙胍對AR可能具有一定的治療作用，其機制可能與抑制p-STAT3和IL-17的蛋白表達有關(guān)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可明顯抑制血清IL-17、IL-6和TNF-α水平，提示二甲雙胍也可減輕AR小鼠的炎癥狀態(tài)。葛安琪等[14]采用二甲雙胍對骨癌痛模型小鼠干預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，小鼠脊髓背角中p-STAT3蛋白表達顯著降低；楊明峰等[15]采用二甲雙胍對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠干預(yù)處理后也發(fā)現(xiàn)大鼠脾臟Th17細胞和IL-17表達顯著降低；以上研究結(jié)果與本實驗結(jié)果基本一致，間接證實二甲雙胍能抑制p-STAT3和IL-17的表達。

綜上所述，二甲雙胍在一定程度上可減輕AR模型小鼠鼻黏膜組織的炎癥狀態(tài)，并降低外周血炎性因子的表達水平，其機制可能與抑制p-STAT3蛋白表達有關(guān)，本研究為今后實現(xiàn)STAT3單克隆抗體治療AR提供理論依據(jù)。本研究未探討在沉默STAT3基因的情況下采用二甲雙胍干預(yù)后各炎性因子的變化，下一步應(yīng)當(dāng)獲取AR患者鼻黏膜組織及外周血，進一步驗證本研究中的相關(guān)指標(biāo)與動物實驗結(jié)果是否一致。