環黃芪醇對慶大霉素誘導小鼠急性腎損傷的保護作用

王 位，馬續祥，陳衛東

(蚌埠醫學院第一附屬醫院腎內科，安徽 蚌埠 233000)

急性腎損傷是指腎功能在短時間內喪失，腎小管過濾功能降低，引起尿素和其他氮質代謝產物潴留、體內電解質紊亂的臨床常見危重病[1]。急性腎損傷的病理生理學機制一般包括白細胞浸潤、炎性因子產生與釋放及自由基氧化等過程[2-3]。由于缺乏有效的治療手段，急性腎損傷常常進展為慢性腎臟疾病，對患者的生活質量造成嚴重影響，且發病率與病死率較高。近年來，藥物引起的急、慢性腎衰竭日益增多，腎毒性藥物已成為導致急性腎損傷的重要病因之一，探尋預防和治療急性腎損傷的藥物具有重要意義。黃芪為豆科植物膜莢黃芪、蒙古黃芪等的干燥根，是傳統補氣中藥，具有補氣健脾、升陽固表等功效[4]。研究發現，黃芪可以改善急性腎損傷，對腎功能有保護作用，但其具體作用機制尚不明確[5]。環黃芪醇是從黃芪中提取的一種環菠蘿烷型四環三萜類化合物，是黃芪藥理作用的重要成分，具有增強機體清除氧自由基能力、抑制過氧化反應等功效。研究表明，環黃芪醇通過抑制氧化應激和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的過量產生，從而預防由醫源性高胰島素血癥引起的腎損傷，說明環黃芪醇對腎損傷可以發揮保護作用[6-7]，但其具體作用機制尚不明確。本研究利用慶大霉素構建小鼠急性腎損傷模型，并采用梯度濃度環黃芪醇進行治療，旨在探討環黃芪醇對急性腎損傷小鼠腎功能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠30只，體質量(20±2)g，購自安徽省實驗動物中心，合格證號：34000200001224。30只小鼠隨機分為空白組、模型組及環黃芪醇低、中、高劑量組，每組6只。小鼠于無特定病原體級環境中飼養，12 h明暗交替，環境溫度20～24 ℃，濕度45%～55%，自由攝食和飲水。本實驗及相關操作均經蚌埠醫學院動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器環黃芪醇購自西安優碩生物科技有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、還原性谷胱甘肽(glutataione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肌酐(creatinine，CRE)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)測試盒購自南京建成生物有限公司，多聚甲醛、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑、過碘酸希夫(periodic acid-schiff，PAS)染色試劑購自北京索萊寶科技有限公司，乙醇、二甲苯購自上海國藥集團化學試劑有限公司，放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation,RIPA)裂解液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)購自博士德生物工程有限公司；SpectraMax190 型全波長酶標儀購自美國MD公司，5415R高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，石蠟切片機、石蠟包埋機、脫水機購自德國Leica公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Olypus公司。

1.3 小鼠急性腎損傷模型制備模型組及環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腹腔注射適量慶大霉素(100 mg·kg-1)，每日1次，連續7 d；同時，環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠分別按200、400、800 mg·kg-1的劑量給予環黃芪醇灌胃，每日1次，連續7 d；空白組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。各組小鼠均于造模第7天給藥后當晚禁食、水，造模第8日經眶內靜脈采血，然后采用頸椎脫臼法處死小鼠，剖腹取雙側腎臟用于后續實驗。

1.4 各組小鼠血清BUN、CRE、SOD、MDA、GSH水平測定各組小鼠均于造模后第8日經眶內靜脈采血1 mL，靜置15 min 后，1 500 r·min-1離心 10 min 取上清液，按照相應試劑盒說明書操作，使用酶標儀通過比色法測定血清BUN、CRE、SOD、MDA和GSH水平。

1.5 各組小鼠腎組織形態學觀察眶內靜脈采血后處死小鼠，剖腹取左側腎臟，生理鹽水沖洗，40 g·L-1多聚甲醛溶液固定48 h，采用梯度乙醇脫水，二甲苯固定，石蠟包埋切片(層厚5～8 μm)，進行常規HE染色和PAS染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察小鼠腎組織病理學表現。

1.6 各組小鼠腎組織中SOD、MDA、GSH 水平測定各組小鼠分別取右側腎組織0.2 g，加入1 mL RIPA裂解液，在冰盒上用玻璃勻漿器研磨，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液提取總蛋白。按照試劑盒的步驟使用酶標儀在550 nm處通過比色法測定腎組織勻漿中SOD、MDA、GSH 水平。

1.7 酶聯免疫吸附試驗檢測各組小鼠腎組織中單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平取0.15 mL腎組織蛋白加入到酶標板中，先加等體積的雙蒸水稀釋，再每孔加入 0.3 mL 酶標抗體工作液，37 ℃暗處孵育60 min,蒸餾水洗滌3次，采用自動酶標儀在450 nm處檢測吸光度值，通過比色法計算各組小鼠腎組織中 MCP-1、TNF-α水平。

2 結果

2.1 各組小鼠腎組織病理學表現結果見圖1和圖2。HE染色顯示，空白組小鼠腎小管管壁呈充盈狀態，細胞質豐富，細胞核藍色深染(圖1A)；模型組小鼠腎小管上皮細胞大部分受損壞死，細胞質大量減少，部分細胞的細胞核變大，間質充滿炎性細胞(圖1B)；環黃芪醇低劑量組小鼠部分腎小管上皮細胞溶解消失，間質有炎性細胞浸潤，腎小管集中區域有網狀改變，與模型組小鼠比較腎組織病理情況有所改善(圖1C)；環黃芪醇中、高劑量組小鼠腎小管上皮細胞基本完整，管壁變薄，細胞質減少，與模型組小鼠比較腎組織病理情況明顯改善(圖1D、圖1E)。PAS染色顯示，空白組小鼠基底膜結構完整，著色較淺(圖2A)；模型組小鼠腎組織腎小球內系膜紅色深染，基底膜增厚，提示腎小球內糖原大量沉積，損傷嚴重(圖2B)；環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠基底膜與空白組比較均有所增厚，但與模型組比較有改善，腎小球的糖原沉積也明顯減少，腎組織的病理情況顯著好轉(圖2C、圖2D、圖2E)。

A:空白組；B：模型組；C：環黃芪醇低劑量組；D：環黃芪醇中劑量組；E：環黃芪醇高劑量組。

圖1 各組小鼠腎組織病理變化(HE染色,×200)

Fig.1 Pathological changes of kidney tissues of mice in each group(HE staining,×200)

A:空白組；B：模型組；C：環黃芪醇低劑量組；D：環黃芪醇中劑量組；E：環黃芪醇高劑量組。

圖2 各組小鼠腎組織病理變化(PAS染色,×200)

Fig.2 Pathological changes of kidney tissues of mice in each group(PAS staining,×200)

2.2 各組小鼠血清BUN、CRE、SOD、MDA、GSH水平比較結果見表1。與空白組比較，模型組及環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠血清BUN、CRE、MDA 水平顯著升高，SOD 和 GSH 水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠血清 BUN、CRE、MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異均有統計學意義 (P<0.05)。與環黃芪醇低劑量組比較，環黃芪醇中、高劑量組小鼠血清 BUN、CRE、MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異均有統計學意義 (P<0.05)。與環黃芪醇中劑量組比較，環黃芪醇高劑量組小鼠血清 BUN、CRE、MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異均有統計學意義 (P<0.05)。

表1 5組小鼠血清BUN、CRE、SOD、MDA、GSH水平比較

組別nBUN/(mmol·L-1)CRE/(μmol·L-1)SOD/(ng·L-1)MDA/(μmol·L-1)GSH/(mg·L-1)空白組67.58±0.82 42.30±3.72 122.68±10.52 4.92±0.32 254.36±15.63 模型組624.46±3.02a77.67±6.67a78.58±6.78a6.52±0.54a176.48±26.34a環黃芪醇低劑量組622.17±1.67ab75.75±3.26ab85.86±12.03ab6.13±0.13ab192.33±18.36ab環黃芪醇中劑量組616.47±2.38abc71.28±3.12abc91.25±14.32abc5.87±0.06abc208.13±19.54abc環黃芪醇高劑量組68.64±1.75abcd51.59±4.07abcd106.16±8.97abcd5.33±0.11abcd221.56±14.65abcd

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與環黃芪醇低劑量組比較cP<0.05；與環黃芪醇中劑量組比較dP<0.05。

2.3 各組小鼠腎組織中SOD、MDA、GSH、MCP-1及TNF-α水平比較結果見表2。與空白組比較，模型組及環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織MDA水平顯著升高，SOD、GSH水平顯著降低，差異有統計學意義 (P<0.05)。與模型組比較，環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與環黃芪醇低劑量組比較，環黃芪醇中、高劑量組小鼠腎組織MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與環黃芪醇中劑量組比較，環黃芪醇高劑量組小鼠腎組織MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

與空白組比較，模型組及環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與環黃芪醇低劑量組比較，環黃芪醇中、高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與環黃芪醇中劑量組比較，環黃芪醇高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 5組小鼠腎組織中SOD、MDA、GSH、MCP-1和TNF-α水平比較

組別nSOD/(U·mg-1 pro)MDA/(mmol·g-1 pro)GSH/(mg·L-1)MCP-1/(μmol·g-1)TNF-α/(μmol·g-1)空白組6152.72±15.68 7.31±0.42 376.58±48.35 6.72±1.98 2.18±1.02 模型組691.68±19.87a12.65±0.84a216.36±43.67a24.62±3.69a6.89±1.35a低劑量組695.86±15.14ab11.13±0.58ab236.23±51.26ab19.78±2.53ab5.14±0.97ab中劑量組6130.52±12.42abc10.86±1.12abc281.13±49.57abc14.02±1.97abc4.51±0.84abc高劑量組6142.56±13.77abcd9.03±0.84abcd315.36±39.42abcd9.18±2.03abcd3.24±1.14abcd

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與環黃芪醇低劑量組比較cP<0.05；與環黃芪醇中劑量組比較dP<0.05。

3 討論

急性腎損傷是一種由多種復雜原因導致的臨床綜合征，目前，其具體發病機制尚不明確，可能有以下幾種：(1)通過炎性因子途徑介導急性腎小球腎炎；(2)通過腎小管毒性致急性腎小管壞死；(3)影響腎臟的血流動力學，使腎臟血流灌注減少，造成腎損傷[8-10]。急性腎損傷的病因包括藥物因素、手術因素、慢性疾病等。藥物因素是導致急性腎損傷的首位病因，其中以氨基糖苷類藥物最常見[11-12]。慶大霉素是一種療效確切的氨基糖苷類抗生素，能夠作用于細菌體內的核糖體，從而抑制細菌的蛋白質合成，并可破壞細菌細胞膜的完整性，主要用于治療革蘭陰性菌引起的感染，但其腎毒性一直受到關注。慶大霉素的水溶性較高，但血漿蛋白結合率較低，在體內幾乎無法進行代謝轉化，只能以原形從腎臟排泄，當慶大霉素進入腎臟近曲小管上皮細胞時容易蓄積，從而損傷細胞內的多種細胞器，使細胞變性壞死，腎臟功能紊亂；同時，慶大霉素還可以抑制線粒體的功能，產生氧代謝產物，引起腎組織損傷。

黃芪為傳統中草藥，具有補中益氣、健脾利水的作用，臨床用于治療糖尿病腎病、慢性腎炎蛋白尿。有文獻報道，黃芪能減少尿蛋白，改善腎功能，并可以減輕小管間質纖維化[13]。環黃芪醇是從黃芪中提取的中藥單體,具有較好的藥理活性，研究表明，環黃芪醇可以改善急性腎損傷[7]。近年來，藥物引起的急、慢性腎衰竭日益增多，探尋預防和治療急性腎損傷的藥物具有重要意義。因此，本研究通過制備慶大霉素誘導的小鼠急性腎損傷模型，并給予環黃芪醇干預，以探討環黃芪醇對慶大霉素誘導小鼠急性腎損傷的保護作用及其機制。

本研究中，小鼠腎組織病理組織學觀察顯示，空白組小鼠基底膜結構完整，腎小管管壁充盈，細胞結構正常；模型組小鼠基底膜增厚，腎小球內糖原大量沉積，損傷嚴重，腎小管上皮細胞大部分受損壞死，間質充滿炎性細胞，且模型組小鼠血清BUN、CRE水平顯著高于空白組，說明慶大霉素導致小鼠發生急性腎損傷。環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠基底膜與空白組比較均有所增厚，但與模型組比較有改善，腎小管上皮細胞損傷明顯減輕，腎小球的糖原沉積也明顯減少，腎組織的病理情況明顯改善，且血清BUN、CRE水平較模型組顯著降低，說明環黃芪醇能夠改善慶大霉素導致的小鼠急性腎損傷。

氧自由基反應和脂質過氧化反應在機體內處于平衡狀態，維持體內的新陳代謝。當體內氧化和抗氧化功能失衡時，會發生中性粒細胞炎性浸潤，大量氧化中間產物生成，從而導致組織損傷。有研究表明，慶大霉素導致的急性腎損傷與氧化應激反應有關[14]。SOD和GSH是人體內重要的酶抗氧化系統的主要成員，MDA則是機體內重要的脂質過氧化代謝產物。本研究通過檢測比較慶大霉素誘導急性腎損傷小鼠血清和腎組織中MDA、SOD和GSH水平，觀察小鼠腎組織脂質過氧化程度和細胞氧化損傷情況，結果顯示，與空白組比較，模型組及環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠血清及腎組織中MDA水平顯著升高，SOD和GSH水平顯著降低，說明慶大霉素導致了小鼠腎組織氧化應激損傷；與模型組比較，環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠血清及腎組織中MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，且隨著環黃芪醇劑量的增加，環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠血清及腎組織中MDA水平逐漸降低，SOD、GSH水平逐漸升高，提示環黃芪醇可以有效降低小鼠氧自由基生成，緩解氧化應激情況，改善腎組織細胞氧化性損傷程度，通過改善小鼠體內氧化應激反應而對急性腎損傷發揮保護作用。

炎癥反應在急性腎損傷發生、進展過程中也發揮重要作用。研究發現，損傷的腎小管上皮細胞會通過釋放MCP-1、TNF-α等炎性因子參與炎癥細胞的趨化與活化過程，導致炎癥反應加重[8]。與空白組比較，模型組及環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織中炎性因子MCP-1、TNF-α水平顯著升高；與模型組比較，環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平顯著降低；且隨著環黃芪醇劑量的增加，環黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平顯著降低；說明環黃芪醇可以有效降低急性腎損傷小鼠腎組織中的炎性因子水平，從而對急性腎損傷發揮保護作用。

綜上所述，環黃芪醇可以顯著降低急性腎損傷小鼠血清CRE、BUN水平，并有效改善病理癥狀；另一方面，可以使急性腎損傷小鼠血清和組織中MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，改善腎組織氧化性損傷程度；并顯著降低小鼠腎組織中 MCP-1、TNF-α水平，改善腎臟炎癥反應。但急性腎損傷病因尚不明確，環黃芪醇是否還通過其他途徑干預這一過程，尚需要進一步研究。