microRNAs在糖尿病視網膜病變發病機制中的作用

姚曉楠，王良雨，彭麗俊，于丹陽，周占宇

0引言

過去30a里，全球糖尿病患病率幾乎翻了一番，2017年約有4.25億人患有糖尿病[1]。糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病遠期并發癥中最常見的一種，可導致糖尿病性黃斑水腫的發生和視力的喪失[2]。視網膜血管對高血糖最早的反應是血管擴張和血流改變，這種變化引起視網膜代謝自動調節，增加糖尿病患者的視網膜代謝[3]。隨著疾病的發展，毛細血管無灌注區的產生可導致新生血管開始生長，發展成為增殖性DR。而DR的這些病理改變是通過缺氧、慢性炎癥、氧化應激、糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)形成、腎素-血管緊張素通路、生長因子、脂質氧化及其產物等多種機制激活的[4-6]。多種細胞因子可以激活DR病理方面的信號通路，包括視網膜新生血管形成和黃斑水腫，其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)會誘導血管的通透性增加，促進新生血管的生成，在DR的發病機制中起著重要作用[5]。磷脂酶Cγ、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、Ca2+、細胞外信號調節蛋白激酶、蛋白激酶B等通路的激活參與介導VEGF的多種功能，包括生存、增殖、遷移、增加血管滲透性和基因表達。

1 DR發病機制中microRNAs的作用

microRNAs是一類非編碼小RNA，通過與靶基因mRNA的3’-UTR(3’-untranslated regions)相互作用，抑制mRNA的翻譯或誘導其降解，在轉錄后水平調節靶基因的表達，是調控基因表達的關鍵參數[7-8]。microRNAs不僅控制靶mRNAs的翻譯和穩定性，而且還參與許多細胞的活動[9]。一些研究表明，microRNAs水平的改變在視網膜血管功能改變和血管生成相關疾病的病理變化中具有重要作用[10](表1)。因此，microRNAs可以作為干預視網膜新生血管形成的合適分子靶點[11-13]。新生血管形成是DR發病機制中一個重要的病理改變，所以microRNAs在DR的發生中也有一定的作用。視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞對正常視力起著至關重要的作用。VEGF升高時可以促進RPE細胞增殖[14]，使血管通透性增加，導致視網膜滲出、出血、水腫[15]。有些microRNAs可以在生理和病理狀態下影響RPE，miR-328基因在RPE細胞中表達，應用維甲酸處理RPE細胞可能導致miR-328表達增加，同時miR-328也可以通過直接下調人類配對盒基因6(Pax6)引起RPE細胞增殖增加[16]。miR-204/211可以調控RPE細胞的分化[17]。VEGF水平升高可誘導miR-17、miR-20a、miR-18a、miR-31等在糖尿病患者視網膜細胞中表達水平上調，進而可能介導VEGF在DR中的不良作用。近年來的研究表明，miR-106a、miR-146、miR-181、miR-199a、miR-214、miR-424、miR-451在缺血視網膜細胞中顯著升高，而miR-31、miR-150、miR-184水平下降，眼內注射miR-31、miR-150和miR-184能夠顯著減少視網膜新生血管形成[18]。以下將通過文獻回顧，探討不同microRNAs在DR新生血管形成機制中的作用。

表1 不同類型microRNAs在新生血管形成中的作用機制

microRNAs作用機制miR-146降低纖維連接蛋白的表達;抑制核轉錄因子-κB(NF-κB)的激活通路。microRNA-34a通過抑制富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體4(LGR4)和c-Met基因表達以抑制視網膜色素上皮細胞(RPE)細胞的生長、遷移和增殖。microRNA-155通過抑制多肌醇-5-磷酸酶(SHIP1)增強PI3K-Akt信號通路引起視網膜新生血管形成。microRNA-182通過抑制肝細胞生長因子抑制RPE細胞的增殖和遷移。microRNA-126通過下調有絲分裂原激活蛋白激酶通路中的p38,抑制VEGF、胰島素生長因子-2(IGF-2)和低氧誘導因子-1α(HIF-1α);下調胰島素受體底物-1(IRS-1)的表達抑制PI3K/Akt通路和血管生成;調控視網膜血管細胞黏附蛋白-1(VCAM-1)和Bcl-2的表達。microRNA-410通過下調VEGF基因表達抑制視網膜新生血管形成。microRNA-133b下調Rho相關蛋白激酶信號通路抑制RPE細胞增殖,并促進其凋亡。microRNA-29通過靶向Akt2參與RPE細胞中轉化生長因子-β1(TGF-β1)介導上皮間充質轉化(EMT)的過程。microRNA-124影響參與RPE細胞表型改變的靶基因。microRNA-132通過激活腎素血管緊張素系統(RAS)途徑誘導新生血管形成。microRNA-152與腎素原受體(PRR)mRNA相互作用共同調節視網膜內皮細胞中VEGF和TGF-β1的表達。microRNA-184通過抑制Wnt信號通路,防止缺血誘導的視網膜新生血管形成。microRNA-218通過抑制環狀誘導受體1(Robo1)的表達,作為氧誘導視網膜新生血管的調節劑。microRNA-15a/16抑制視網膜內皮細胞中的TGF-β3、SMAD2/3磷酸化和VEGF水平,增加緊密連接蛋白和閉鎖蛋白(occlu-din)的水平。microRNA-200b/c抑制視網膜細胞的增殖和遷移;降低視網膜細胞VEGF基因表達、血管生成和葡萄糖誘導的細胞通透性;下調抗氧化物1(Oxr1)和TGF-β1的水平。

1.1 microRNA-146miR-146家族有miR-146a和miR-146b兩種。miR-146a可以降低纖維連接蛋白的表達，減輕微血管纖維化，Feng等[19]研究發現，miR-146a在糖尿病大鼠眼內表達降低。另外，核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)可以促進凋亡小體的表達，引起視網膜血管周細胞凋亡和無細胞毛細血管的增加，導致視網膜局部微循環障礙[20]，而miR-146可以抑制NF-κB的激活通路，使其成為DR的治療靶點[21]。

1.2 microRNA-34miR-34a是多種腫瘤的抑癌因子，可影響沉默信息調節因子-1、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、c-Met (cellular-mesenchymal to epithelial transition factor)基因、多種細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶等靶基因的表達[22]。miR-34a通過抑制富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體4(leucine rich repeat containing G protein coupled receptor 4，LGR4)和c-Met基因表達來抑制RPE細胞的生長、遷移和增殖。c-Met基因在DR患者RPE細胞中高表達，參與RPE細胞的增殖和遷移，因此抑制c-Met基因可作為控制RPE參與DR的基因靶點[23]。LGR4是miR-34a的另一個直接靶基因，可調控急性視網膜色素上皮-19(acute retinal pegment epitheliitis-19，ARPE-19)細胞的增殖、遷移和黏附。miR-34a表達增加可以抑制LGR4表達和ARPE-19細胞的增殖遷移，因此miR-34a和LGR4可能介導細胞周期進程的控制。綜上，miR-34a可能在視網膜疾病的治療中具有重要的臨床療效[22]。

1.3 microRNA-155miR-155可在RPE細胞中表達，缺氧和VEGF的激活可以誘導miR-155的表達。miR-155能提高缺氧誘導因子-1/2(hypoxia inducible factor-1/2，HIF-1/2)的活性，后者可促進VEGF的表達。在動物模型中抑制miR-155可以下調含有多肌醇-5-磷酸酶(SHIP1)和PI3K/pAkt信號通路的SH2結構域，從而減少視網膜新生血管的形成、增殖和遷移；而miR-155過表達后3’-UTR抑制了SHIP1，使PI3K/pAkt信號通路增強。因此，PI3K-pAkt信號通路直接參與miR-155表達和SHIP1水平的調控[24-25]。

1.4 microRNA-182miR-182對視網膜的發育和功能可能有著重要的調控作用，是維持成人錐體光感受器外段和視覺功能所必需的。肝細胞生長因子具有誘導RPE細胞增殖和遷移的作用，miR-182可以通過靶向c-Met途徑抑制肝細胞生長因子[26]。在DR患者的視網膜中miR-182的表達顯著降低，導致c-Met和PI3K/Akt信號通路上調，提示miR-182表達下調可能參與DR的發生[27]。因此，上調miR-182表達可能對改善增殖性視網膜病變并發癥有治療作用[28]。

1.5 microRNA-126miR-126與血管生成密切相關，是PDR中篩選視網膜內皮損傷或血管并發癥的生物標志物之一[29-30]。miR-126可以通過下調有絲分裂原激活蛋白激酶通路中的p38，直接抑制VEGF高水平和胰島素生長因子-2(insulin growth factor-2，IGF-2)，并間接抑制低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)，從而導致視網膜新生血管減少[31-32]。HIF-1α的大量表達可以導致VEGF水平的上調，反之亦然[33]。VEGF和HIF-1α在DR和其他視網膜疾病的進展中有重要作用，包括年齡相關性黃斑變性和視網膜缺氧反應，這種交叉干擾可能有顯著的治療意義[31]。另外，miR-126可能通過懸浮細胞周期發育抑制VEGF和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表達來抑制新生血管形成[34]，但在缺氧條件下，miR-126表達下調。miR-126的表達增加可以抑制高血糖誘導的內皮細胞的遷移和發育，這可能是由于VEGF/PI3K/AKT信號通路中VEGF被阻斷所致。有研究表明，miR-126對PI3K/Akt通路和血管生成的抑制作用是由于該miRNA下調胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)的表達。基于目前的研究，miR-126可以直接或間接調控視網膜血管細胞黏附蛋白-1(vascular cell adhesion protein-1，VCAM-1)和Bcl-2的表達，這二者是視網膜病變中BRB破壞過程中必不可少的細胞因子[35]。因此，miR-126在視網膜中起保護作用，保護BRB完整性和神經元存活，在DR的發病機制中發揮重要的作用。

1.6 microRNA-410miR-410是視網膜新生血管形成的調控因子，可誘導多種細胞中VEGF基因表達下調。一些研究人員已經證明，含有miR-410的滴眼液可以成功抑制DR模型眼中新生血管的形成[19]。miR-410直接調控RPE特異性因子基因，抑制miR-410的表達可誘導這些因子過表達。總的來說，miR-410的抑制作用可以融入細胞分化中，利用其給藥可以成為治療DR的一種新的細胞治療技術[36-37]。

1.7 microRNA-133b目前有證據表明，miR-133b可通過下調Rho相關蛋白激酶信號通路抑制DR模型中RPE細胞增殖，并促進其凋亡[38]。

1.8 microRNA-29microRNA-29可能通過靶向Akt2參與RPE細胞中轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)介導上皮間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的過程。增殖性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)被認為是由RPE細胞的EMT驅動的纖維化過程，引起視網膜牽拉并導致手術失敗。一些研究表明，NF-κB途徑激活可抑制microRNA-29，導致RPE細胞中MMP-2蛋白表達上調引起新生血管生成。因此，這些發現可能會為未來預防或治療PVR的發生提供新的臨床治療策略[39]。

1.9 microRNA-124miR-124參與靶基因的表達，這些靶基因參與DR中RPE細胞向其他表型RPE細胞的轉分化。miR-124在EMT進展過程中表達水平下調。有文獻報道，miR-124的外源性補充將是預防或治療PVR的一種有價值的治療方法[40]。

1.10 microRNA-132miR-132可通過對新生血管刺激因子的作用，在血管過度增殖、血管瘤和腫瘤血管發生中發揮重要作用，對新生血管形成過程中起調節作用[41]。腎素血管緊張素系統(renin angiotensin systems，RAS)通路在包括VEGF在內的多種細胞因子的下游發揮作用，活躍于發育中的血管和病理血管網絡。miR-132類似于一個“血管生成開關”，通過RAS途徑激活誘導新生血管形成，而抗miR-132藥物的應用通過維持血管處于靜息狀態來抑制新生血管形成[42]。以miR-132作為基因靶點可能對治療多種眼部新生血管性疾病和預防視力喪失有幫助[43]。

1.11 microRNA-152在高血糖的狀態下，miR-152可以直接與腎素原受體(pro-renin receptor，PRR)mRNA相互作用共同調節人類視網膜內皮細胞中VEGF和TGF-β1的表達。TGF-β不僅可以促進內皮細胞的增生、黏附和細胞外基質沉積[44-45]，還可以通過增加纖維連接蛋白合成導致血管纖維化[46]。PRR和RAS在視網膜內皮細胞及其他眼組織血壓的生理和病理生理調節中具有重要作用[47]。目前證據表明，RAS抑制劑在DR中可能會產生有益的作用[48]。

1.12 microRNA-184miR-184富含于眼病患者的玻璃體中[49]，能抑制視網膜Wnt信號通路。Wnt信號是一種胞內信號通路，由Wnt配體、共受體和細胞內信號級聯組成，調控包括細胞分化和血管生成在內的多種細胞過程。有報道稱，視網膜Wnt信號通路異常激活是DR模型中視網膜炎癥和視網膜新生血管形成的主要致病機制[50-52]。缺血狀態時，miR-184表達減少導致Wnt信號通路異常活化，誘導視網膜新生血管形成。因此，在DR中通過Wnt信號通路預防炎癥反應和新生血管形成，可能成為一種新的治療方式[53]。

1.13 microRNA-218miR-218由slit基因內含子編碼，該內含子抑制環狀誘導受體1(roundabout guidance receptor1，Robo1)以及參與硫酸肝素生物合成途徑的多個因子的表達。miR-218-slit基因-Robo調控網絡是視網膜正常血管化的關鍵，而miR-218基因表達的下調導致信號軸異常調控，內皮細胞異常遷移，視網膜血管卷積減少[54]。因此，miR-218通過與Robo1的3’-UTR結合使Robo1表達下調，可以作為缺氧誘導視網膜新生血管的調節劑。研究表明，Robo1在內皮細胞遷移和新生血管形成中具有積極作用，降低Robo1可明顯抑制內皮細胞遷移。所以，下調Robo1可顯著抑制DR視網膜新生血管形成[55]。

1.14 microRNA-15a/16Ye等[56]證實，在高血糖狀態時，miR-15a/16可抑制視網膜內皮細胞中的TGF-β3、Smad2/3磷酸化和VEGF水平，增加緊密連接蛋白和閉鎖蛋白(occludin)的水平。在體外誘導的高血糖條件下，miR-15a/16過表達可抑制VEGF，引起視網膜內皮細胞通透性降低。因此，miR-15a/16可能是治療DR的潛在分子靶點[56]。

1.15 microRNA-200b/cmiR-200b/c通過下調血管抑制蛋白-2(vasohibin-2，VASH-2)表達抑制視網膜細胞的增殖和遷移，可以對高糖引起的人視網膜微血管內皮細胞功能障礙發揮保護作用[57]。近年研究表明，VASH-2可在骨髓來源的單核細胞中特異性表達，在血管生成中發揮重要作用。一些研究已經闡述了被DR損傷的內皮細胞纖維血管膜中血管生成與VASH2之間的關系，是DR潛在治療靶點之一。因此，miR -200b/c也可能成為治療視網膜新生血管形成的一種新方法。另一方面，miR-200b可降低糖尿病大鼠視網膜細胞VEGF基因表達、血管生成和葡萄糖誘導的細胞通透性。miR 200b還可下調抗氧化物1(oxidation resistance 1，Oxr1)和TGF-β1的水平，具有保護視網膜細胞凋亡的作用[58]。

2總結與展望

綜上所述，不同microRNA在視網膜新生血管形成中具有不同的作用，可對DR發生和發展過程發揮重要的作用，在DR發展過程的任何階段都應研究不同類型miRNA水平的變化，根據不同病理條件下microRNA表達的變化選擇新穎、高效、適合的治療方法。