超高效液相色譜串聯質譜法測定植物源調味料中氯蟲苯甲酰胺殘留

錢兵 趙婧 何燕 韓丙軍 彭黎旭 王文斌

摘 ?要 ?本研究建立了超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定植物源調味料中氯蟲苯甲酰胺殘留量的分析方法。調味料樣品經改進后的QuEChERS方法前處理，選擇C18超高效液相色譜柱進行分離，采用電噴霧離子源正離子模式、多反應監測方式進行采集，外標法定量。結果表明，方法在0.005～0.200 ?g/mL范圍內線性相關系數均優于0.999，加標回收率在70%～108%之間，相對標準偏差在1.9%～10%之間。方法檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.005 mg/kg。該方法操作簡便快速、靈敏、準確性高，適用于植物源調味料中氯蟲苯甲酰胺的殘留量檢測。

關鍵詞 ?超高效液相色譜-串聯質譜法;植物源調味料;氯蟲苯甲酰胺

中圖分類號 ?X839.2 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?A simple and efficient method based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） detection was developed to analyze the residue of chlorantraniliprole in plant-derived condiment. The condiment samples were pretreated with a modified QuEChERS method， and separated on an UPLC C18 column. The analyses of chlorantraniliprole were operated with electrospray ionization mass spectrometry under positive mode using a multiple reaction monitoring mode， and then quantitatived by an external standard method. The results showed that the correlation coefficients of the calibration curves were over 0.999 in linear range of 0.005–0.200 ?g/mL. The average recoveries at three spiked concentration levels varied from 70% to 108% with relative standard deviations （RSDs） of 1.9%–10%. The limits of detection （LOD） and quantitation （LOQ） was 0.002 mg/kg and 0.005 mg/kg， respectively. In conclusion， this simple and efficient method meet the method validation requirements for the determination of chlorantraniliprole residues in plant-derived condiment.

Keywords ?UPLC-MS/MS; plant-derived condiment; chlorantraniliprole

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.030

氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）是一種高效、低毒、廣譜的新型殺蟲劑[1]，主要作用方式為胃毒作用和觸殺作用，結構式見圖1。其作用機理為激活蘭尼堿受體，釋放平滑肌和橫紋肌細胞內儲存的鈣，從而引起肌肉調節衰弱、麻痹，最終導致害蟲死亡[2]，被廣泛用于鱗翅目害蟲[3]。近年來被廣泛使用于蔬菜、水果和糧食作物上的蟲害防治[4-5]。

圖1 ?氯蟲苯甲酰胺化學結構式

Fig. 1 ?Structure formula of chlorantraniliprole

隨著氯蟲苯甲酰胺在不同農作物生產中廣泛使用，其在農產品及食品中可能引起的殘留風險受到人們的廣泛關注。我國《食品安全國家標準 ?食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763-2016）規定了氯蟲苯甲酰胺在谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、堅果、糖料及調味料等不同農產品及食品中的殘留限量。但是，由于我國尚未制定氯蟲苯甲酰胺在農產品中殘留檢測方法標準，目前國家標準GB 2763-2016規定的氯蟲苯甲酰胺殘留限量為臨時限量。因此，迫切需要建立氯蟲苯甲酰胺在不同農產品及食品中的殘留檢測方法，為氯蟲苯甲酰胺的監管提供技術支持。

目前，氯蟲苯甲酰胺的檢測分析方法主要使用高效液相色譜法[6]和液質聯用法[7]，主要涉及的農產品及食品包括谷物和油料作物[8-9]、蔬菜[10-12]、甘蔗等糖料作物[13-14]、水果[15]及動物源性食品[16]等，但是尚未見調味料等農產品中氯蟲苯甲酰胺殘留檢測方法的報道。在已報道文獻中，基于QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前處理凈化方法具有快速、便捷等優點，被廣泛用于各類農產品及食品中氯蟲苯甲酰胺的提取和凈化[9-10]。但是，由于植物源調味料的特殊氣味通常由硫化物、酚類、醇類化合物等構成[17-19]，其基質比較復雜，使用常規QuEChERS方法凈化處理后，在使用高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）進行分析時容易產生嚴重的干擾，引起回收率偏低。因此，本文利用改進的QuEChERS方法對植物源調味料進行凈化處理，建立高效液相色譜-串聯質譜（UPLC- MS/MS）測定植物源調味料中氯蟲苯甲酰胺殘留量的分析方法。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試樣品：從海口市場抽取蔥、大蒜、干辣椒、黑胡椒、白胡椒等樣品各20個，其中蔥為新鮮植株可食部分，大蒜為去皮后可食部分，干辣椒、黑胡椒、白胡椒均為干樣;從海南、安徽、湖南等產地抽取姜與姜莖樣品各20個，其在田間施用5%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑7 d后采集樣品。姜莖和蔥樣品切斷后用打漿機粉碎，姜和大蒜樣品直接使用打漿機粉碎，干辣椒、黑胡椒和白胡椒使用粉碎機進行制備，得到待測樣品。

實驗儀器包括超高壓液相色譜系統（美國Waters公司），AB SCIEX API4000+質譜系統（美國AB SCIEX公司），ACQUITY UPLC?BEH?C18色譜柱（100?mm×2.1 mm×1.7 ?m，美國Waters公司），高速勻漿機（德國IKA公司），微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

本實驗用水均為超純水，由美國Millipore超純水系統制備;乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher試劑公司）;氯化鈉（分析純，廣州化學試劑廠）;PSA吸附劑（N-丙基乙二胺，分析純，Biocomma公司）;1000 ?g/mL氯蟲苯甲酰胺標準溶液，購自農業農村部環境質量監督檢驗測試中心（天津）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?樣品的前處理 ?實驗使用改進的QuEC hE RS方法對氯蟲苯甲酰胺進行提取和凈化。準確稱取調味料樣品10.0 g 樣品至50 mL離心管中，為提高提取效率，干樣使用超純水進行潤濕，其中姜莖樣品加入2?mL超純水、黑胡椒和白胡椒樣品加入10?mL超純水、干辣椒樣品加入12?mL超純水，然后再加入20?mL乙腈進行提取;高速勻漿2?min，加入1.5?g?NaCl，蝸旋劇烈振蕩1?min后，以4000?r/min的轉速離心5?min，分取5?mL上清液轉入10 mL的PSA（150 mg）凈化管中，同時加入C18吸附劑，渦旋劇烈振蕩1 min，再以4000?r/min的轉速離心5?min，取上清液2.0?mL經0.22 ?m微孔濾膜過濾，使用UPLC-MS/MS進行測定。

1.2.2 ?儀器分析條件 ?色譜條件：ACQUITY U PL C?BEH?C18色譜柱，柱溫35?℃，進樣量5??L，流速為0.25?mL/min;流動相A為0.2%甲酸水，B為乙腈;梯度洗脫，洗脫程序：0～1 min，90% A;1.0～ 3.5?min，10% A;3.5～5.0 min，90% A。

質譜條件：電噴霧正離子（ESI+）掃描，噴霧電壓4500 V，毛細管溫度600?℃;多反應監測（MRM）模式。分別選擇484.1/285.9和484.1/ 452.7作為定量和定性離子，去簇電壓為82.1 V，碰撞電壓分別為20.0、22.0 V。

2 ?結果與分析

2.1 ?前處理方法的選擇

傳統農藥殘留分析時往往需要復雜的前處理步驟，樣品制備成本較大，提取溶劑使用量多，凈化步驟繁瑣。QuEChERS方法因其分析速度快、抗干擾能力強、靈敏度高等獨特的優勢，已經廣泛應用于農藥殘留實驗的前處理。由于調味料樣品中含有大量揮發性硫化物、酚類、醇類化合物等雜質[17-19][9]，在使用QuEChERS方法進行前處理時，樣品凈化效果不佳。因此，在PSA凈化時加入C18粉末進行協助凈化，實驗首先對比了加入C18粉150 mg后樣品的凈化效果，實驗結果見圖2A。C18材料的加入可以有效地去除調味料樣品中復雜基質對氯蟲苯甲酰胺提取率的影響，將氯蟲苯甲酰胺的回收率從42%～72%提高到81%～ 103%。實驗進一步優化了不同質量的C18粉末對氯蟲苯甲酰胺提取率的影響，實驗結果見圖2B。結果表明，當C18質量從50 mg增加至150 mg時，不同調味料基質中氯蟲苯甲酰胺的回收率從39%～68%提高到89%～106%，當C18質量從150?mg增加至250 mg時，氯蟲苯甲酰胺的回收率無顯著變化，因此，在后續的實驗中添加150?mg的C18粉末進行凈化。

2.2 ?檢測條件優化

2.2.1 ?液相色譜條件 ?使用C18超高壓液相色譜柱對氯蟲苯甲酰胺進行測定，結果發現，氯蟲苯甲酰胺在C18色譜柱上具有較好的保留性，可以滿足分析的需求。實驗進一步比較了乙腈水和乙腈-0.2%甲酸水2種流動相體系，結果表明，加入0.2%甲酸與乙腈-水流動相中，在改善峰型的同時還可使基線更加穩定。在正離子模式下，0.2%甲酸的加入還增加了氯蟲苯甲酰胺離子化所需的H+，不僅增強了離子化效率，還提高了檢測靈敏度。因此選取了乙腈-0.2%甲酸水體系作為流動相。同時優化調整了0～1.0?min、1.0～3.5?min、3.5～ 5.0?min，3個時間段流動相中乙腈和0.2%甲酸水的比例，確定了最佳的梯度洗脫條件。

2.2.2 ?質譜條件優化 ?本方法的典型色譜圖見圖3，采用多反應監測模式（MRM）進行檢測，MRM可以通過消除背景干擾來提高檢測靈敏度。首先對0.5??g/mL的氯蟲苯甲酰胺標準溶液注入ESI離子源中，在正離子檢測方式下進行一級質譜分析，得到穩定且豐度高的母離子碎片m/z 484.1。進一步優化去簇電壓后，對母離子碎片進行二級質譜分析，得到二級質譜碎片的全譜信息。優化碰撞電壓，選擇兩個信號最強的兩個碎片離子m/z 285.9、m/z 452.7離子對，分別作為定量離子和定性離子進行分析。

A：0.5 ?g/mL基質標準溶液;B：空白樣品;

C：0.5 ?g/mL加標回收樣品。

A： ?Standard in matrix solution， 0.5 ?g/mL;

B： Blank sample; C： Spiked ginger sample， 0.5 ?g/mL.

2.3 ?基質效應

實驗分別使用姜、姜莖、蔥、蒜、干辣椒、黑胡椒、白胡椒等7種調味料空白樣品，按照樣品提取方法對樣品進行前處理，得到樣品提取液，分別使用純溶劑和樣品提取液配制0.005、0.050、0.200 ?g/mL 3個濃度水平氯蟲苯甲酰胺溶液，分別測定得到純溶劑中農藥的響應值（A）和樣品提取液中農藥響應值（B），則樣品基質效應= A/B×100%。實驗結果表明，經過前處理后植物源調味料樣品的基質效應在91%～115%，說明本方法具有很好的凈化效果，可以較好的去除樣品中基質的干擾。

2.4 ?標準曲線及方法檢出限

以濃度1000 ?g/mL的氯蟲苯甲酰胺標準溶液作為母液，使用甲醇逐級稀釋法分別配置0.005、0.02、0.05、0.1、0.2 ?g/mL的系列標準溶液，外標法進行定量，按所確定檢測條件，以氯蟲苯甲酰胺對照溶液濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程Y=2795500X+22700，線性關系良好，相關系數優于0.999。以定量離子響應的3倍信噪比和10倍信噪比（S/N）分別計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），得到氯蟲苯甲酰胺的LOD和LOQ分別為0.002 mg/kg和0.005 mg/kg。其中，LOQ低于國標GB 2763-2016中所規定的最低氯蟲苯甲酰胺殘留限量值（0.02～20 mg/kg），滿足國家標準的相關要求。

2.5 ?回收率及方法的精密度

以不含氯蟲苯甲酰胺的植物源調味料空白樣品，分別在0.005、0.05、0.2 mg/kg 3個水平進行加標回收率實驗，每個濃度平行5次，相關結果見表1所示。實驗結果的加標平均回收率在70%～ 108%之間，相對標準偏差（RSD）在1.9%～10%之間。參考NY/T 788-2004農藥殘留試驗準則，實驗結果加標回收率和相對標準偏差均符合農藥殘留測定允許范圍，說明方法的準確度符合殘留檢測要求。

2.6 ?實際樣品檢測

利用本方法進行檢測對抽取的樣品進行檢測，所有樣品均配制基質標準進行定量分析。結果表明，研究所抽取的姜、蔥、蒜、干辣椒、黑胡椒、白胡椒等樣品均未檢出氯蟲苯甲酰胺，20個姜莖樣品中，有6個樣品被檢出，濃度范圍為0.082～0.263 mg/kg。本方法具有良好的靈敏度和重現性，可用于滿足市場樣品監測的需求。

3 ?結論

植物源調味料中含有大量硫化物、酚類、醇類化合物通常影響農藥殘留的定量分析，其回收率較低。傳統的QuEChERS方法使用PSA作為凈化材料，由于PSA材料的硅膠表面鍵合極性官能團，主要吸附樣品中的強極性雜質，如有機酸、色素以及糖等。C18材料含有十八烷基，對非極性物質有較高的容量，其可去除油脂等非極性雜質，并對樣品中硫化物等雜質具有很好的去除效果。因此，本方法同時使用PSA和C18材料進行凈化，有效地去除了樣品中的雜質干擾。此外，由于干辣椒、胡椒等樣品含水量較低，使得氯蟲苯甲酰胺的回收率偏低，因此在提取過程中加入2?mL超純水，提高了方法的回收率，保證了方法在樣品分析時的回收率在70%～108%之間，滿足了分析的需求。

串聯質譜具有良好的選擇性和靈敏度，近年來已經發展成為農藥殘留分析的主要技術，但是方法在對于復雜樣品分析的時候容易受到基質效應的干擾，對實驗結果產生影響。本研究選擇使用改進后的QuEChERS方法進行前處理，采用高效液相色譜串聯質譜法檢測植物源調味料中氯蟲苯甲酰胺殘留，重點通過PSA和C18材料對樣品中的極性和非極性雜質進行凈化，有效地消除了不同性質雜質對樣品分析的影響，保證了方法的準確性，在測定范圍內線性關系較好，平均回收率和RSD均滿足檢測要求，可很好的滿足植物源調味料中氯蟲苯甲酰胺殘留量的檢測分析。

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