分散固相萃取法測定黃瓜中的喹啉銅殘留量

陳思宇 王明月 林冰 呂岱竹

摘 ?要 ?建立了分散固相萃取（d-SPE）-高效液相色譜（HPLC）分析測定黃瓜中喹啉銅殘留量的方法。樣品采用乙腈和0.1 mol/L鹽酸混合溶液提取，C18填料凈化，高效液相色譜儀分離，紫外檢測器檢測。其色譜條件為：色譜柱SunFireC18（4.6×150 mm，5 ?m），流動相為十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液乙腈（65∶35）體系，流速0.6 mL/min，檢測波長250 nm。結果表明：在0.02、0.2、2 mg/kg三個添加水平下，喹啉銅回收率在92.3%～107.7%之間，相對標準偏差（RSD）在2.0%～7.7%之間。該方法操作簡單、靈敏度和準確度高，能夠用于黃瓜中喹啉銅的殘留分析。

關鍵詞 ?黃瓜;喹啉銅;分散固相萃取;高效液相色譜法

中圖分類號 ?X839.2 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?A high performance liquid chromatography （HPLC） coupled with the dispersive solid phase extraction （d-SPE） method for the determination of oxine-copper residue in cucumber was established. The sample was extracted by acetonitrile and hydrochloric acid （0.1 mol/L）. The extract was purified by C18. The analysis was carried out by phosphate buffer saline （PBS） and sodium dodecyl sulfate （SDS） -acetonitrile （65∶35） at a flow rate of 0.6 mL/min on SunFireC18 （4.6×150 mm， 5 ?m） column， and detected by HPLC with UV detector at a ultraviolet absorption wavelength of 250 nm. The recovery was in 92.3%107.7% with relative standard deviation （RSD） of 2.0%7.7% at spiked levels of 0.02， 0.2 and 2 mg/kg. The method is simple， sensitive and accurate， and could be used in the determination of oxine-copper residue in cucumber.

Keywords ?Cucumis sativus L.; oxine-copper; dispersive solid phase extraction; high performance liquid chromatography

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.029

8-羥基喹啉銅（oxine-copper，簡稱為喹啉銅）是黃瓜上常用的一種廣譜、高效、低毒的有機銅螯合物殺菌劑，噴施后在植物表面形成藥膜，釋放殺菌的銅離子，可有效抑制病菌的萌發和侵入，對梨、蘋果、黃瓜、西瓜和番茄等作物真菌和細菌性病害起到預防和治療作用[1-2]。喹啉銅的使用雖然可以減少農業病蟲害，但過量使用會造成農藥殘留，通過食物被人體吸收，銅在人體內達到一定濃度時可形成羥基自由基的催化劑，造成人體DNA的損傷，誘發癌細胞的生成[3]，世界衛生組織國際癌癥研究機構將喹啉銅歸為第三類致癌物質[4]。因此建立準確快速的喹啉銅殘留檢測方法，是評價蔬菜水果中喹啉銅殘留風險和監管農產品市場的必要手段。喹啉銅的傳統測定方法有氧化-還原滴定法[2]，該方法是通過目測顏色變化確定終點，準確度不高，需要大量人力及分析時間，不適于大批量樣品的檢測。喹啉銅主要檢測方法有氣相色譜法，姚杰等[5-6]采用氣相色譜法測定蘋果中喹啉銅的殘留量，該方法需要將喹啉銅進行化學衍生反應，通過檢測生成的8-羥基喹啉含量計算喹啉銅含量，前處理操作復雜耗時。高效液相色譜法測定喹啉銅殘留量有相關報道[7-11]，肖浩等[12]和周夢春等[13-14]采用高效液相色譜測定稻田、番茄、黃瓜和土壤樣品中喹啉銅殘留量，以液液萃取的凈化方法進行提取，正相和反相兩次萃取之后旋轉蒸發濃縮，凈化操作繁瑣。針對這一點，本研究優化了提取和凈化方法，采用乙腈加少量鹽酸進行提取，減少了提取劑用量和提取時間;用分散固相萃取替代液液萃取凈化的方法，操作簡單、凈化效率高;同時采用十二烷基硫酸鈉離子對磷酸鹽緩沖液流動相體系，能使喹啉銅與雜質更好地分離，從而建立了黃瓜中喹啉銅殘留量簡單、快速、準確的分析測定方法。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

Waters e2695高效液相色譜儀和2489紫外檢測器，美國沃特世公司;Milli-Q Advantage A10超純水系統，德國默克密理博公司;CR22N落地式高速冷凍離心機，日本日立公司;AL204電子天平，上海梅特勒·托利多儀器有限公司;KQ-500DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;UMV-2多管旋渦混合器，北京優晟聯合科技有限公司。

98.2%喹啉銅標準品，德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司;二甲基甲酰胺和85%磷酸（分析純），廣州化學試劑廠;磷酸二氫鈉（分析純），汕頭市光華化學廠有限公司;十二烷基硫酸鈉（分析純），Farco Chemical Supplies;鹽酸（優級純），廣州化學試劑廠;多壁碳納米管（MWCNTs）和C18填料，上海安譜實驗科技股份有限公司;PSA填料，深圳藍色海貝公司;實驗用水均為一級水。

1.2 ?方法

1.2.1 ?標準曲線的繪制 ?稱取5 mg喹啉銅，以二甲基甲酰胺超聲溶解并定容至100 mL，得到50??g/mL的喹啉銅標準儲備液，用乙腈稀釋至0.01、0.05、0.1、0.5、1.5 ?g/mL 5個濃度;以喹啉銅的濃度為橫坐標，對應的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 ?樣品的提取與凈化 ?稱取10 g黃瓜樣品于50 mL塑料離心管，加入14 mL乙腈和1 mL 0.1?mol/L的鹽酸，渦旋10 min，加入10 g氯化鈉，渦旋1 min，以8000 r/min離心5 min。

稱取50 mg C18填料于15 mL塑料離心管，加入上述上清液5 mL，渦旋1 min，以8000 r/min離心5 min，上清液待上機測定。

1.2.3 ?高效液相色譜檢測條件 ?紫外檢測器（UVD）;SunFireC18色譜柱（4.6×150 mm，5??m）;進樣量10 ?L，柱溫25?℃，十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液為2.5 mmol/L磷酸二氫鈉+1.25 mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液，用磷酸調pH至3.0;流動相為十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液和乙腈（65∶35）體系，流速0.6 mL/min，檢測波長250 nm。在此條件下，喹啉銅的保留時間為6～8 min。

1.3 ?數據處理

以標準系列溶液進樣，待測農藥的濃度（?g/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標制作標準曲線，確定線性范圍，根據標準曲線方程計算相關系數，證明在實驗條件范圍內儀器響應與進樣濃度呈線性關系。以保留時間進行定性分析，以外標法進行定量分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?方法的線性關系、靈敏度、準確度和精密度

在上述條件下以喹啉銅質量濃度為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標，在0.01～1.5 ?g/mL范圍內的線性關系為y=221 000x3 700，r2=0.998。通過在黃瓜空白樣品添加喹啉銅0.02、0.2、2 mg/kg 3個濃度、每個濃度5個平行的加標回收實驗，加標回收率和相對標準偏差（RSD）結果見表1，色譜圖見圖1。結果表明，喹啉銅不同添加濃度的回收率在92.3%～107.7%，相對標準偏差在2.0%～7.7%，用添加法測定喹啉銅的最低含量，得出黃瓜中喹啉銅的檢出限（LOD）為0.08?mg/ kg，最大殘留限量（MRL）為2 mg/kg，因此該方法的靈敏度、準確度和精密度均符合農藥殘留分析要求。

2.2 ?提取條件的優化

喹啉銅不溶于多數有機溶劑，微溶于稀酸、吡啶等，在水中溶解度也很小，僅為0.0001%。因此本方法采取在乙腈中加入酸的方式對黃瓜中喹啉銅進行提取率的實驗，結果見圖2。從圖2可以看出，用乙腈提取的黃瓜空白樣品，在目標物保留時間處有雜峰干擾，而用鹽酸乙腈溶液提取的無雜峰干擾，說明加入一定濃度的鹽酸可去除部分雜質，從而提高了準確度。同時考察了乙腈中加入不同濃度鹽酸對回收率的影響，結果見圖3。當樣品中喹啉銅添加水平為0.1 mg/kg，濃度較高時，直接用乙腈和乙腈加入0.1 mol/L鹽酸提取沒有太大的差別，回收率均為94.5%，乙腈加入0.5 mol/L和2 mol/L鹽酸提取，回收率偏低，分別為45.0%和39.0%;當樣品中喹啉銅添加水平為0.02?mg/ kg，濃度較低時，直接用乙腈提取，喹啉銅保留時間為6～8 min;A：乙腈加入0.1 mol/L鹽酸提取;B：直接用乙腈提取。

2.3 ?流動相的優化

本研究考察了乙腈水、乙腈磷酸鹽緩沖液、乙腈十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液3個不同體系的流動相，色譜圖見圖4。乙腈水流動相體系中喹啉銅響應很小，乙腈磷酸鹽緩沖液流動相體系中喹啉銅保留時間在2 min左右，無法與黃瓜基質中的雜峰分開。

乙腈十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液體系中分離效果好，響應高，其主要原因是十二烷基硫酸鈉為離子對試劑，加入到流動相后與喹啉銅生成不帶電荷的中性離子，增加喹啉銅與固定相的作用，使分配系數增加，喹啉銅的保留時間由此前的2 min延長為7 min左右，從而達到更好的分離效果。但是十二烷基硫酸鈉對C18柱有一定程度的損傷，影響其使用壽命，濃度越高，損傷越大。本研究同時考察了pH為3時2.5、1.25、0.625?mmol/L 3個濃度的十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相，以期得到喹啉銅峰形較好，十二烷基硫酸鈉濃度較低的流動相。結果表明，十二烷基硫酸鈉濃度為2.5 mmol/L時，流動相易產生乳白色沉淀，難以抽濾;濃度為0.625 mmol/L時，喹啉銅出峰較早，保留時間為4 min左右，受雜峰干擾;濃度為1.25 mmol/L時，喹啉銅峰形較好，響應較高，周圍無雜峰干擾，因此選擇1.25?mmol/L十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相體系。

A：乙腈水;B：乙腈磷酸鹽緩沖液;C：乙腈0.625 mmol/L十二烷基硫酸鈉酸鹽緩沖液;

D：乙腈1.25 mmol/L十二烷基硫酸鈉酸鹽緩沖液。

A： Acetonitrile and water; B： PBS-acetonitrile; C： PBS and SDS （0.625 mmol/L）-acetonitrile;

D： PBS and SDS （1.25 mmol/L）-acetonitrile.

2.4 ?凈化條件的選擇

本研究比較了多壁碳納米管、C18和PSA填料凈化對回收率的影響，結果見圖5。多壁碳納米管具有較高比表面積和較強的物理吸附能力[15]，有利于色素類和極性物質的去除。多壁炭納米管不同用量下的回收率表明，多壁碳納米管用量超過10 mg時，回收率低于70.0%，達不到農藥殘留分析要求。C18填料是一種硅膠基質吸附劑，通過疏水作用吸附非極性和弱極性化合物。C18填料不同用量下的回收率表明：C18填料用量50 mg時回收率為100.4%，用量100 mg時回收率為97.0%，當用量超過300 mg時，回收率低于70.0%，達不到農藥殘留分析要求。PSA填料為乙二胺基-N-丙基硅烷，極性比C18填料強，對中等極性的多種化合物具有較好的吸附能力。PSA填料不同用量下的回收率表明：PSA填料用量對回收率的影響不明顯，均在95.9%～102.2%之間。從凈化效果來說，多壁碳納米管用量超過10 mg，色素去除較為干凈，上機液澄清，C18和PSA填料用量增加，上機液顏色變化不大;從色譜圖來看，50 mg C18填料凈化后雜峰更少，因此選擇50?mg C18填料進行凈化。

A： 多壁碳納米管; ?B： C18和PSA

A： Multi-walled carbon nanotubes; B： Octadecylsilane and primary-secondary amine absorbent

3 ?討論

本研究以分散固相萃取-高效液相色譜法進行分析，快速、簡單、準確度高，目前喹啉銅尚無檢測方法標準，據文獻報道，喹啉銅分析方法現在主要有氣相色譜法[5-6]和高效液相色譜法，氣相色譜法需要將喹啉銅衍生化為8-羥基喹啉，前處理操作繁瑣，易引起目標物的損耗。液相方法無需衍生，其方法準確度更高，王志新等[5]用氣相色譜法檢測了蘋果中喹啉銅，其回收率在79.8%～98.3%之間，本方法回收率在92.3%～ 107.7%之間。同時我們對提取和凈化方法進行了優化，目前喹啉銅的提取方法有超聲、振蕩和勻漿，王志新等[5]用30 mL提取劑振蕩60 min提取，肖浩等[12]用80 mL提取劑超聲30 min提取，提取劑用量大，提取時間長，本研究以15 mL鹽酸乙腈溶液渦旋10 min提取，節省了提取劑用量和提取時間。本研究采用分散固相萃取法進行凈化，相比現有的固相萃取法[7]和液液萃取法[10]凈化，前處理操

作簡單，節省人力和時間。在色譜分離方面，肖浩、周夢春等人用高效液相色譜法[12-14]測定水稻、土壤、番茄和黃瓜中喹啉銅，均采用5 mmol/L十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相體系，本方法采用1.25 mmol/L的十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相體系，十二烷基硫酸鈉濃度低，分離效果好，并且對C18柱及色譜系統的損傷更小。通過回收率試驗證明，本方法精密度和準確度高、檢出限低、結果重現性好，回收率和相對標準偏差均達到農藥殘留分析要求，可用于大批量黃瓜樣品中喹啉銅殘留的分析檢測。

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