基于釕(Ⅱ)多吡啶配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+的單鏈DNA分子光開關性能

宋偉 涂小寶 祁慧晨 徐加發 田丹碧

摘要：在合成DNA的熒光探針[Ru（bpy）2dppz]2+（RuBD）的過程中，初步發現了其特別的分子光開關特性，不僅取決于雙鏈DNA（dsDNA）還取決于單鏈DNA（ssDNA）。當RuBD與水溶液中的DNA酶結合時，熒光強度在dsDNA / RuBD和ssDNA / RuBD之間顯示出明顯的差異。此外在實驗中，發現ssDNA / RuBD比dsDNA / RUDB的熒光更強，故我們采用熒光光譜，熒光顯微鏡和電化學法等方法，進一步研究RuBD與ssDNA的性質。

關鍵詞：釕（Ⅱ）多吡啶配合物;分子光開關;單鏈DNA（ssDNA）;雙鏈DNA（dsDNA）

雖然釕（Ⅱ）多吡啶配合物 [Ru（bpy）2（dppz）]2+作為核酸的光譜探針已有二十多年的歷史，其獨特的性質在生物化學、細胞生物學、診斷和治療方面的應用前景直到最近才受到重視[1-5]。作為體外和離體的理想探針，它已被用于實時跟蹤技術，該技術使用熒光顯微鏡監測活細胞中的單個病毒組分或DNA序列，因為它們具有強烈的雙鏈DNA（dsDNA）結合親和力，低背景輻射、長壽命光開關效應和紅移發射[6-9]。

RuBD的光開關效應普遍認為歸因于dsDNA堿基之間高度平面dppz配體的插入[1，10-13]，使得條帶研究和應用僅涉及dsDNA。單鏈DNA （ssDNA）的光開關效應似乎被忽略，對它的研究很少。

在設計以RuBD為熒光探針的Pb2+熒光傳感器過程中，我們首先發現RuBD的光開關效應不僅依賴于與dsDNA的結合，還依賴于與ssDNA的結合。我們進一步采用熒光光譜法、熒光顯微鏡等，研究ssDNA對RuBD的性質。我們希望我們的發現有助于更清楚地呈現RuBD DNA的結合機制，對其未來的生物應用提供新思維，RuBD在新型診斷劑方面具有重要應用價值，此類診斷劑不僅適用于雙鏈DNA /單鏈DNA，以及用于核酸位點和結構的通用治療[14-18]和生物化學探針設計[19-21]。

[Ru（bpy）2（dppz）]（BF4）2 的合成遵循文獻[22，23]，采用熒光光譜法研究RuBD的結合性能。結果表明，與雙鏈DNA結合的RuBD熒光明顯增強，說明RuBD的結合作用（圖1）。

我們在脫氧核酶（DNAzyme）裂解反應中發現了RuBD的特殊性質，它可以在ssDNA存在時產生顯著的熒光效應，這一特性這已被應用于制備Pb2+ 生物傳感器 [24]。

8-17 ssDNA，是一種對Pb2+有特異性催化作用的單鏈DNA分子。這種DNA分子生產成本低，可多次變性和復性且不喪失活性或結合能力，特別是其催化鏈可以借助Pb2+，催化底物鏈的裂解[25，26]。

在我們最初的設計策略中，僅僅基于RuBD與dsDNA的結合能力，故選用RuBD作為熒光探針。但在試驗過程中，結果超出了我們的預期。

熒光光譜可以發下RuBD在5mM Tris緩沖溶液中具有可忽略的熒光（圖2，粉紅色三角形點）。當RuBD與8-17 dsDNA溶液混合時，熒光強烈發射（紅色圓點），證明了RuBD典型的光開關特性。通過添加Pb2+，8-17 dsDNA核酶水解成8-17 ssDNA和一些底物片段。如果RuBD的光開關效應僅取決于dsDNA的插入，那么含有8-17 ssDNA和信號鏈底物片段的混合液的熒光強度將降低或檢測不到。但令人驚訝的是，該混合溶液的熒光強度顯著增強（～75%）（黑色四角點）。

用一種特殊設計的GR-5 DNA核酶進行DNA的裂解反應，其性能與8-17 DNA核酶相似。發現該溶液的熒光強度也增大，說明RuBD與雙鏈DNA可以產生較強熒光，也可以與單鏈DNA產生較強熒光。為了驗證RuBD的分子熒光開關性能，我們分別使用DNA dsDNA和ssDNA溶液（8-17 dsDNA和8-17ssDNA，GR-5 dsDNA和GR-5 ssDNA）測試熒光強度。 通過向溶液中添加等量的RuBD，產生的熒光強度如圖3，由此我們發現，ssDNA / RuBD的熒光強度增強尤其顯著，約增強250%（GR-5 ssDNA/RuBD，綠色三角形點）和300%（8-17ssDNA/ RuBD，藍色四角點）。

為了進一步確認RuBD的熒光特性，我們設計了兩個長度相同但結構不同的DNA，其中一個（DNA/H）呈發夾狀，另一個（DNA/S）呈直線狀。圖4顯示，在相同條件下，RuBD與DNA/S結合產生的熒光強度強于DNA/H，且與熒光顯微鏡圖像結果一致。 與DNA/H相比，RuBD與單鏈DNA/S結合產生更強更顯著的熒光特性。

RuBD可能通過靜電作用與ssDNA結合，盡管聯吡啶配體部分插入的可能性不能完全消除[28-31]。我們采用循環伏安法（CV）進一步考察。通過巰基-金的相互作用，將5'末端具有硫醇的ssDNA固定在工作電極金電極表面。將ssDNA修飾的電極在封閉試劑MCH溶液中進一步孵育，以獲得良好排列的DNA單層，防止RuBD進入電極表面。分別在緩沖液（a）和RuBD溶液（b）中對修飾電極進行循環掃描，在RuBD溶液中電流峰值明顯增強（見圖5）。采用計時庫侖法進行實驗，也具有一致的結果。由于RuBD的靜電吸附，峰值電流可歸因于表面受限的氧化還原過程，證明了我們先前假設的吸附作用（圖6）。

綜上所述，釕（Ⅱ）多吡啶配合物（RuBD）不僅可以插入dsDNA，還可以插入ssDNA，值得引起我們關注的是，其和ssDNA作用時產生的熒光強度遠遠大于dsDNA。我們希望關于RuBD的分子光開關特性能引起科學界的關注，其在化學傳感、生物傳感、生物示蹤、熒光成像、超分辨成像等領域表現出極大的潛在應用價值，值得進一步研究開發。

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