拮抗菌HM-7培養基的優化

唐蕊 張雪輝 鄭佳

摘? ?要： 以拮抗菌HM-7的光密度值為評價指標，采用單因素試驗和正交試驗，對培養基中的碳源、氮源、無機鹽進行了優化，利用分光光度法確定最優培養基，旨在提高拮抗菌HM-7的產菌量，為進一步研究拮抗菌HM-7提供一定的依據和參考，同時為生物防治在生活中廣泛應用奠定基礎。結果表明，拮抗菌HM-7的最佳培養基配方為葡萄糖2 g、酵母膏8 g、NaCl 4 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.0，在此條件下培養24 h，更利于菌體生長，為擴大培養拮抗菌HM-7打下了基礎。

關鍵詞： 拮抗菌; 培養基; 正交試驗; 優化

Abstract：The optical density of the antagonistic bacteria HM-7 was used as evaluation index， the carbon source nitrogen source and inorganic salt in the medium were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment， and the optimal conditions were determined by spectrophotometry. The aim of this study was to improve the yield and to provide a basis for the further study of antagonistic bacteria HM-7， meanwhile， it would lay the foundation for the extensive application of biological control in life. The results showed that the optimal medium of antagonistic bacteria HM-7 was glucose 2 g， yeast extract 8 g， NaCl 4 g， distilled water 1000 ml， pH 7.0， under these conditions， the growth of bacteria was much better than other formulas. Our results laid a foundation for expanding the culture of antagonistic bacteria HM-7.

Key words： Antagonistic bacteria; Culture medium; Orthogonal experiment; Optimization

近年來，環境問題顯露，人們的環保意識增強，隨著人類對化學防治和物理防治的質疑越來越多，促進農業發展、維護生態環境的生物防治逐漸深入人心，受到人類關注。生物防治主要包括以蟲治蟲、以菌治蟲、以菌治菌3類，通過生物間競爭作用、抗生作用、寄生作用、溶菌作用及誘導抗性對植物體發揮作用，具有選擇性強、無污染、兼防兼治保持生態平衡等優點[1] 。生物防治能夠很快的深入人心，得到人民的普遍認可，完全取決于其對人體無害且能更好的防治病蟲害，因此需要大力推進生物防治的發展，讓生態環境越來越好，人民幸福感提升。自古代廣東省利用黃柑蟻防治柑橘害蟲后，國內外學者開始進一步研究生物防治，因此生物防治成為防治病蟲害研究的一大熱點[2]。唐蕊等[3]從土壤中分離出對黃瓜枯萎病有拮抗作用的拮抗菌HM-7，鑒定為生防芽孢桿菌中的解淀粉芽孢桿菌，其具有廣泛的抑菌范圍，能夠抑制黃瓜等多種作物的病害，提高植物抗蟲性和抗逆性，因此有著良好的發展前景。

筆者通過對拮抗菌HM-7培養基的優化，得到一個適合生長的培養基，給菌株提供良好的生活環境，提高產菌量。同時對拮抗菌HM-7的擴大培養和儲存具有重要意義，為其以后應用于生物防治提供保障，也為生物防治能廣泛的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為邢臺學院微生物實驗室分離且保藏的拮抗菌HM-7，基礎培養基為牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 原菌液的制備 將微生物實驗室保存的拮抗菌HM-7活化2 h，轉移至基礎培養基中在37 ℃、120 r·min-1的條件下振蕩培養24 h，得到拮抗菌HM-7的原菌液[4]。

1.2.2 單因素試驗 碳源優化試驗：分別選擇葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉作為碳源，保證基礎培養基的其他組分一樣。添加0.4%的碳源到未含碳源的基礎培養基中，確保pH為7.0，以5%的接種量將原菌液接種到培養基中，在37 ℃，120 r·min-1的條件下培養24 h。用分光光度計測定600 nm處波長的光密度值，確定最佳碳源[5-6]。

氮源優化試驗：分別選擇蛋白胨、酵母膏、豆粕、氯化銨、尿素作為氮源，基礎培養基中的其他組分不變。添加1.0%的氮源到未含氮源的基礎培養基中，確保pH為7.0，以5%的接種量將原菌液接種到培養基中，在37 ℃，120 r·min-1的條件下培養24 h。用分光光度計測定600 nm處波長的光密度值，確定最佳氮源[5-6]。

無機鹽優化試驗：分別選擇NaCl、 KCl、 K2HPO4、 KH2PO4、MgSO4 作為無機鹽，基礎培養基中的其他組分不變。添加0.5%的無機鹽到未含無機鹽的基礎培養基中，確保pH為7.0，以5%的接種量將原菌液接種到培養基中，在37 ℃，120 r·min-1的條件下培養24 h。用分光光度計測定600 nm處波長的光密度值，確定最佳無機鹽[5-6]。

1.2.3 正交試驗 利用葡萄糖、酵母膏、NaCl 3個因素和不同添加量3個水平制成因素水平表1，采用L9（34）正交試驗表來進行正交試驗，測定其對拮抗菌HM-7生長的影響，最終得到最優培養基。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 碳源對拮抗菌HM-7的影響 碳源優化試驗結果如圖1所示，從圖中可以看出，各個碳源對拮抗菌HM-7的生長影響不同，其中可溶性淀粉最差，蔗糖、麥芽糖、牛肉膏相差不大，葡萄糖作為唯一碳源時，拮抗菌HM-7的光密度值為1.990，高于其他碳源。葡萄糖為單糖，容易被細菌吸收并利用，所以當葡萄糖作為碳源時，菌體生長最好，能夠達到最優狀態;圖2為葡萄糖作為唯一碳源時不同添加量對菌體生長的影響情況，圖2表明不同的葡萄糖添加量對菌體生長也會有明顯的影響。在供試濃度變化范圍內出現了偏低或偏高均不利于其生長的結果，故可以得出，當添加量為0.3%時，菌體生長達到最好，此時光密度值為2.075。

2.1.2 氮源對拮抗菌HM-7的影響 氮源優化試驗結果如圖3所示，從圖中可以看出，不同氮源對拮抗菌HM-7的生長影響差異非常顯著。其中酵母膏作為唯一氮源時，拮抗菌HM-7的生長情況為最佳，此時的光密度值為2.197，蛋白胨次之，豆粕居中，氯化銨菌體生長量小，尿素最次。酵母膏高于其他有機氮源，成為最佳氮源。圖4是酵母膏作為唯一氮源時不同添加量對菌體生長的影響情況，圖4表明不同的添加量對菌體生長不像碳源那樣明顯，但也會有一定的影響。在供試濃度變化范圍內說明酵母膏添加量為0.8%時更利于菌體的生長，光密度值達2.152，為最佳濃度。

2.1.3 無機鹽對拮抗菌HM-7的影響 無機鹽優化試驗結果如圖5所示，從圖中可以看出，不同無機鹽對拮抗菌HM-7的生長影響差異比較顯著。從圖5看出，KCL、NaCl、MgSO4作為唯一無機鹽時，拮抗菌HM-7的菌體生長量，相差不大，光密度值均在2左右，其中NaCl最佳，此時光密度值為2.043。K2HPO4和 KH2PO4作為唯一無機鹽時，光密度值明顯降低，說明其不利于菌體的生長。圖6為NaCl作為唯一無機鹽時不同添加量對菌體生長的影響情況，結果表明不同的添加量對菌體生長也會有明顯的影響。在供試濃度變化范圍內出現了偏低或偏高均不利于其生長的結果，故可以得出，最合適的添加量為0.4%，此時光密度值為2.106。

2.2 正交試驗結果

對碳源、氮源、無機鹽3類不同培養基質以及不同添加量進行正交試驗。其結果及極差分析如表2所示，通過極差的大小得出不同培養基質對拮抗菌HM-7生長的影響效果。從表2中的OD值可以看出各因素對拮抗菌HM-7生長影響效果的主次順序為C>B>A，即無機鹽（NaCl）>氮源（酵母膏）>碳源（葡萄糖）。通過OD值k值得知適合拮抗菌菌體生長的最佳組合為A1B2C2，所以最適合菌體生長的培養基配方為葡萄糖2 g·L-1、酵母膏8 g·L-1、NaCl 4 g·L-1。

3 討論與結論

通過對培養基中不同培養基質的研究，看出拮抗菌HM-7生長受氮源和無機鹽濃度的影響居多。實驗得出拮抗菌HM-7生長的理想培養基配方為葡萄糖2 g·L-1、酵母膏8 g·L-1、NaCl 4 g·L-1，在此條件下拮抗菌HM-7的生長量較高，適合其生長。

相比于傳統的化學防治，生物防治具有環境污染小、對人畜無害、沒有殘留，能夠在不影響人們生活的情況下防治病蟲害。隨著人們更加注意環境問題，同時對綠色食品的需求有一定提高，生物防治成為了生物科學研究的熱點[7]。郝建安等[8]對解淀粉芽孢桿菌進行了探究，發現其對水稻紋枯病菌、黑痘病菌等有一定的抑制作用;代玉立[9]研究枯草芽孢桿菌菌株RSS-1，發現其能夠對油菜菌核病菌產生抑制;楊凡等[10]研究表明，淡紫紫孢菌pt361菌株能有效防治黃瓜根結線蟲，其對線蟲卵寄生率為72.6%，其菌株混合發酵液對線蟲幼蟲致死率達95.2%;閆建芳等[11]研究表明，鏈霉菌組合ST-2其發酵液對黃瓜枯萎病的相對防效達65.89%，顯著高于對照申嗪霉素39.50%的效果。農業生產中，拮抗菌可以作為微生物農藥來發揮作用，能夠有目的性的殺害病蟲，同時可以保持生態平衡，因此微生物防治相對于化學防治更加容易在人們心中扎根，具有很好的發展前景[12]。但由于人們已經長期使用化學防治來治理病蟲害，并沒有了解到認識到生物防治的優越性，加之生物防治實施受到多種因素影響，防治效果不穩定，因此生物防治沒有大范圍實施到農業和生活中，因此，在提高人們環保意識的同時，還需進行技術的指導，確保生物防治的效果，為其能夠廣泛應用打下堅實基礎。

參考文獻

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