不同植物配置下人工濕地微生物群落特征及其影響因素

賴巧暉, 張 浩, 劉治鵬

(1.廣東農工商職業技術學院, 廣州 510075;2.仲愷農業工程學院, 廣州 510075; 3.廣州市市政工程設計研究總院有限公司, 廣州 510075)

作為一種污水處理方式，人工濕地又稱為蘆葦床系統構建濕地，于20世紀70年代興起，是一種按一定比例融合了礫石、土壤、爐渣等物質后，并將其放入特定植被的一種處理污水的生態系統[1]。其作用原理在于，滿足四大基本要素(水體、基質、水生植被和微生物)的基礎上，通過化學、物理、生物等途徑去除特定污染物[2-3]，已經被普遍運用于水環境富營養化和不同水體的水質凈化中，取得了較好的經濟效益和環境效益[4]。其主要優點為投資少、運行費用低、能源消耗少、經濟美觀等。通常情況下，在人工濕地填充沙和礫石等材料較多，但隨著基質填料研究的深入，礦石及工業副產品等性能較高的物質也逐漸被納入基質填料范圍中，而針對沸石、白云石等混合基質的研究也在不斷進行中[5-6]。除此之外，還開展了針對濕地植物的研究，發現燈心草、美人蕉、香蒲等植物都具備較強的凈化污水的效果，都可以作為理想的濕地植物采用，而這些植物又具備較強的適應性和實用性，不僅生存較易，而且還具有相當程度的美感[7]。綜合以上研究，作為一種高效環保的污水處理技術和生態化處理手段，人工濕地具有廣闊的應用前景與空間。國外學界針對人工濕地的研究，大多集中在廢水及污水處理方面，而我國學界對該方面研究并不深入[8-9]。尤其是運用于環境污染等領域，因此研究人工濕地在污水廢水凈化方面的作用和意義，對于人類的生存和發展具有重要作用。

土壤不僅是人類活動的載體，更是植物生長的載體，土壤微生物和活性直接影響作物的生長，進而對人類活動形成制約，土壤質量的重要標志就是肥力和活性，這也是近年來土壤研究的主要領域之一，其關乎植物生長的全過程，對生態環境起著不可忽視的制約作用[10]，是整個生態系統的重要組成部分，直接決定著生態系統生產力[11]。此外，土壤微生物的影響因素是多種多樣的，其中微生物降解作用是不可忽視的，微生物一方面對地表腐殖質等進行降解使之成為土壤養分，另一方面自身的新陳代謝活動能夠提升土壤活性，大大降低土壤板結等現象，有利于植被恢復和土壤穩定性保持[12-13]；微生物具有很強的環境敏感性，土壤變化能夠及時作用到微生物活動中，說明微生物量具有周轉快的特點[14-15]。作為陸地生態最活躍的成分之一，微生物在促進土壤養分循環方面作用顯著，同時決定著礦物分解效果，其降解作用關乎整個生態環境的正常循環[16-17]。大量的研究數據發現，土壤養分與微生物群落的生長發育密切相關，同時微生物群落的分布也影響到土壤中氮、磷等相關營養成分，二者存在相互影響作用。因此，本文選擇茭白(Zizaniacaduciflora)、鳶尾(Iristectorum)、菖蒲(Acoruscalamus)和蘆葦(Phragmitesaustralis)4種人工濕地，研究不同植物配置下人工濕地微生物群落特征對環境的指示作用，其研究成果可為人工濕地的設計與生活污水的治理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 人工濕地設計與流程

試驗區選擇華南農業大學的人工濕地系統，該系統將底部結構設置為集水區，并在上邊放置尼龍網，其作用為防止填料下漏。將每個人工濕地劃分為4個重復單元，總共16個人工濕地單元。濕地底部被劃分為16個體積為長×寬×深=20 m×5.0 m×1.0 m的人工濕地結構單元，再用0.5 m寬的土埂將每個單元隔開，每個單元所填充的基質大致可分為三層，底層使用粒徑為20—30 mm的大粒徑礫石，設置的厚度為25 cm；中層使用粒徑15—25 mm的當地中號爐渣，設置的厚度為25 cm；上層使用粒徑為10—15 mm的當地小號爐渣和泥沙，厚度也為25 cm。在各濕地單元內，分別種植濕地植被鳶尾(Iristectorum)、茭草(Zizaniacaduciflora)、眼子菜(Potamogetonpectinatus)和菖蒲(Acoruscalamus)，一般保持3～7棵/m2的種植密度。在每個濕地單元中，還要將直徑為10 mm的PVC管呈對角線埋入，以確保循環水從人工濕地中流入PVC管，方便采集試驗樣品。

1.2 樣品采集

2013年5月，先將4種植被放置于微污染水中，馴化1個月后，開始凈化試驗。將鳶尾、茭草、眼子菜和菖蒲4種濕地植被進行株型和生物量趨同的選擇后，栽種于用爐渣做基質的人工濕地上，添加自來水至基質飽和，再進行1個月的地下水培養，使其保持2～3 cm的薄水層，穩定20 d，中間換水3～5次。7月20日，經配水池向人工濕地緩慢注入生活污水，生活污水通過水管勻速流入，會通過布水管緩慢滲入，放水12 h后，停止注水，保持水力負荷控制在0.81 m3/(m2·d)。生活污水在人工濕地中停留大概48～60 h，水經過處理后從底部PVC管排出，再經過1 a的生長以后，測定各項指標。

當人工濕地穩定1 a后，2014年5月20日，在每個單元分別采集鳶尾、茭草、眼子菜和菖蒲人工濕地5株根區土壤(保留1 kg左右)，土壤樣品數量總計90個，將表層的枯落物層去除，將土壤混合均勻后放入實驗室進行分析和測定，之后在經過自然風干(20 d)、去除碎片和部分根后、過80目篩等流程，測定土壤養分，另一份要在室溫4℃條件下保存，用以測定微生物群落多樣性和微生物量，2014—2018年，選取5 a共計450個土壤樣品，重復上述試驗。

待人工濕地穩定1 a后，2014年5月20日分別采集茭草、鳶尾、菖蒲和眼子菜人工濕地根區土壤，每個單元采集5株根區土壤(保留1 kg左右)，共計90個土壤樣品，除去表層的枯落物層，充分混勻后迅速帶回實驗室內分析測定，自然風干(20 d)去除碎片和部分根后過80目篩后測定土壤養分，另一份4℃保存測定土壤微生物群落多樣性和微生物量，2014—2018年重復上述試驗，5 a共計450個土壤樣品。

1.2.1 土壤樣品的測定 土壤的微生物量碳、氮、磷等成分測定將借助于氯仿熏蒸—K2SO4提取法，具體參考學者吳金水等[15]的測量步驟，碳、氮含量的測定分別借助于TOC2500碳分析儀、流動注射儀；磷的測量利用比色法；元素分析儀的使用能夠測定全氮、全碳含量；速效磷、氮分別使用比色法、NaOH—H3BO3法；鉀的測定利用光度計法[18]。

1.2.2 土壤微生物群落功能多樣性 本研究采用Shannon，McIntosh，Simpson指數來衡量微生物群落特征；其對單一碳源的利用通過平均每孔顏色變化率AWCD來表示，該值較大的情況下說明微生物能夠較大程度地利用碳含量，另一方面也說明微生物的豐度較明顯，具體計算公式如下[15]：

AWCD=∑(Ci-Ri)/n

Pi=(Ci-Ri)/∑(Ci-Ri)

其中，培養基孔吸光值用Ci表示，對照孔吸光值為Ri；Pi為吸光的比值；n代表的是基孔數。

H=-∑Pi(lnPi)

Ds=1-∑Pi

1.3 數據分析

Excel 2010.0和SPSS 21.0進行數據統計和方差檢驗，所有數據為5 a的平均值，其中以平均值±標準誤差表示(Mean±SE)，單因素方差分析(One-way ANOVA)，所有原始數據進行對數轉換；變量的顯著性經過的蒙特卡洛(Monte Carlo)檢驗(499次)，CANOCO 4.5軟件進行排序分析。

2 結果與分析

2.1 不同配置人工濕地土壤養分特征

由表1可知，土壤有機碳、全氮、全磷、全鉀、速效磷和堿解氮呈一致的變化規律，均表現為蘆葦>菖蒲>茭白>鳶尾。其中有機碳變化范圍為9.58～15.23 g/kg，均值為12.53 g/kg，蘆葦和菖蒲差異不顯著(p>0.05)，二者顯著高于鳶尾和茭白(p<0.05)；全氮變化范圍1.01～1.45 g/kg，均值為1.26 g/kg，不同人工濕地差異均顯著(p<0.05)；全磷變化范圍0.92～0.98 g/kg，均值為0.97 g/kg，不同人工濕地差異均不顯著(p>0.05)，全鉀變化范圍16.58～23.06 g/kg，均值為21.25 g/kg，茭白和鳶尾差異不顯著(p>0.05)；速效磷和堿解氮變化范圍分別為25.17～32.69，13.11～19.57 mg/kg，其中蘆葦和菖蒲顯著高于茭白和鳶尾(p<0.05)。

2.2 不同配置人工濕地土壤微生物生物量

由表2可知，人工濕地對土壤微生物量有較大的影響，土壤微生物量碳、氮、磷呈一致的變化規律，均表現為蘆葦>菖蒲>茭白>鳶尾。其中微生物量碳變化范圍為321.47～423.03 mg/kg，均值為377.81 mg/kg，不同人工濕地微生物量碳差異均顯著(p<0.05)；微生物量氮變化范圍為75.36～123.59 mg/kg，均值為100.67 mg/kg，不同人工濕地微生物量氮差異均顯著(p<0.05)；微生物量磷變化范圍為13.25～19.03 mg/kg，均值為15.92 mg/kg，茭白和鳶尾差異不顯著(p>0.05)，二者顯著低于蘆葦和菖蒲(p<0.05)；SMBC/SMBN大致表現為鳶尾>菖蒲>茭白>蘆葦，鳶尾顯著高于其他植物(p<0.05)；SMBC/SMBP大致表現為茭白>菖蒲>蘆葦>鳶尾，其中蘆葦和鳶尾差異不顯著(p>0.05)；SMBN/SMBP大致表現為茭白>蘆葦>菖蒲>鳶尾，茭白顯著高于其他植物(p<0.05)。

表1 不同配置人工濕地土壤養分含量

注：相同小寫字母表示差異不顯著(p<0.05)。

表2 不同配置人工濕地土壤微生物量

2.3 不同配置人工濕地土壤微生物群落多樣性

如圖1所示，物種豐富度指數(H)、均勻度指數(E)、和碳源利用豐富度指數(S)均表現為蘆葦>菖蒲>茭白>鳶尾，而優勢度指數(Ds)則表現為鳶尾>茭白>菖蒲>蘆葦。其中不同人工濕地碳源利用豐富度指數(S)差異均顯著(p<0.05)，不同人工濕地優勢度指數(Ds)差異均不顯著(p>0.05)；對于物種豐富度指數(H)和均勻度指數(E)，蘆葦和菖蒲差異不顯著(p>0.05)，二者顯著高于鳶尾和茭白(p<0.05)。

圖1 不同配置人工濕地土壤微生物群落多樣性

2.4 不同配置人工濕地土壤養分與微生物多樣性的相關性

對不同配置人工濕地土壤養分和微生物多樣性進行相關性分析可知(表3)，對于蘆葦濕地，物種豐富度指數(H)與SOC，TN，TK，AN，SMBC和SMBN呈極顯著的正相關(p<0.01)，與TP和AP呈顯著的正相關(p<0.05)；均勻度指數(E)與SOC，TN呈極顯著的正相關(p<0.01)，與TK，AN，SMBC和SMBN呈顯著的正相關(p<0.05)；碳源利用豐富度指數(S)與SOC，TN，AP，SMBC呈顯著的正相關(p<0.05)。對于鳶尾濕地，物種豐富度指數(H)與SOC，TN，TK，AN，SMBC呈極顯著的正相關(p<0.01)，與SMBN呈顯著的正相關(p<0.05)；均勻度指數(E)與SOC，TN呈顯著的正相關(p<0.05)；碳源利用豐富度指數(S)與TK，SMBC和SMBN呈顯著的正相關(p<0.05)。對于茭白濕地，物種豐富度指數(H)與SOC，TN，SMBC呈極顯著的正相關(p<0.01)，與TK，AN，SMBN呈顯著的正相關(p<0.05)；均勻度指數(E)與SOC，TN呈顯著的正相關(p<0.05)；碳源利用豐富度指數(S)與TN，TK，AN，SMBC呈顯著的正相關(p<0.05)。

對于菖蒲濕地，物種豐富度指數(H)與SOC，TN，TK，AN，SMBC和SMBN呈極顯著的正相關(p<0.01)，與TP和SMBP呈顯著的正相關(p<0.05)；均勻度指數(E)與SOC，TN，SMBC呈極顯著的正相關(p<0.01)，與TK和SMBN呈顯著的正相關(p<0.05)；碳源利用豐富度指數(S)與SOC，TN，AP，AN，SMBC和SMBN呈顯著的正相關(p<0.05)。

表3 各土壤環境因子之間的相關關系(n=450)

注：**相關性在0.01水平上顯著(雙尾)；*相關性在0.05水平上顯著(雙尾)。

2.5 不同配置人工濕地土壤微生物群落多樣性排序分析

本研究通過RDA排序分析來對群落多樣性及環境因子之間的關系開展相應分析，這種分析方法可以同時對多個環境影響因子開展研究，畢竟影響微生物群落分布的環境因素存在多樣性，通過這種分析能夠對其與環境因子之間的關系開展多方面研究。本研究過程中的群落樣方有限，因此將與前四軸無關的環境因子去除，之后再開展相應的分析研究。從表4可知，第一個排序軸的特征值根為0.616，與環境因子在0.01的檢驗水平下達到顯著，相關系數達到0.946；第二排序軸的特征值根達到0.126，物種與環境因子顯著正相關，且相關系數達到了0.568，前兩個排序軸的累積解釋度達到了92.7%，這說明排序是準確的，分析方法是正確的，則排序效果是滿意的。

微生物群落分布受到多方面環境因子的制約，二者之間存在復雜的相互影響關系，具有很強的相關性，本研究過程中通過冗余分析來探究二者之間復雜關系。環境因子是微生物活動的影響載體，不同環境因子的綜合作用會對微生物產生明顯不同的影響，冗余分析方法正是基于多個影響因子下的關系分析，這種分析方法建立在多因素作用的基礎上，將微生物群落分布作為響應變量，而養分、微生物量等作為解釋變量，通過該分析方法找尋影響較大的環境因子。通過RDA排序分析不難看出，第一、二排序軸的解釋度分別達到了56.3%，32.1%，并在0.05的檢驗水平下達到顯著；通過試驗分析得知，土壤養分能夠顯著正相關作用于微生物生長及其新陳代謝活動，微生物活動離不開必要的養分支撐，能夠促進其生長發育等活動；從第一排序軸可以發現，有機碳及全氮顯著影響微生物活動，成為影響其群落分布的最主要環境因子之一。

表4 典范對應排序軸特征值及解釋比例

圖2 濕地植被與環境因子的RDA二維排序圖

3 討論與結論

在自然情況下，因為生長環境的不同，濕地植物會形成不同生活型的群落。在凈化污水過程中，植物群落種間會相互影響和作用，產生積極或消極的影響。不同植物群落類群由于自身種類和生長狀態方面存在的差異性，形成不同的土壤微生物群落。而土壤微生物驅動和維持了人工濕地中的能量交換與物質循環，對生態系統的穩定性具有一定的促進作用[20]。本研究發現，在不同的空間配置前提下，4種濕地植物群落土壤有機碳、全磷、全鉀、全氮、堿解氮和速效磷的變化規律一致，表現為鳶尾<茭白<菖蒲<蘆葦。這說明菖蒲和蘆葦具有極強的凈化水質的作用，因為菖蒲和蘆葦的根系比較發達，群落構成比較復雜，能夠有效促進微生物的生長發育。而在不同的濕地中，植物自身的生長能力、提供氧氣的能力、對污染物的吸收轉化能力等都存在較大的差異性。不論是同一物種，還是不同物種，在不同的濕地中，往往表現出不同的凈化功能[21-22]。所以，將濕地植物進行多種選擇與搭配，不僅能夠使植物之間產生優勢互補的效果，還能保持對營養及有機物較好且更穩定的凈化效果，從而保證濕地系統發揮穩定的生態功能。綜上所述，與鳶尾和茭白群落相比，菖蒲和蘆葦群落的生物多樣性更高，凈化效果更好，生態系統更加穩定，這說明科學合理的植物配置對環境的凈化效果與系統生物多樣性具有促進和提高作用[23-24]。

土壤質量不僅能夠直接用土壤肥力、活性等指標進行衡量，同時也能根據微生物量來衡量，微生物量碳、氮、磷是重要的肥力指標反映之一[25]，這些成分能夠被植被作為養分加以吸收利用，利于土壤肥力改善。從另一個方面來說，微生物量也是土壤質量動態變化的反映指標之一；微生物活性及結構受到多種環境因子的制約，單純依靠微生物量難以充分反映其活性、功能等特性，但其絕對量也是重要的反映指標之一，且不同微生物成分的比例也是重要的影響因素；本研究中蘆葦和菖蒲微生物量含量更高，進而促進物質代謝活動。相關性分析表明不同濕地微生物物種豐富度指數(H)與SOC，TN密切相關，通過RDA分析得知，該地區微生物群落分布具有一定的多樣性，主要的影響因子不僅包括SOC，TN，還包括SMBC和SMBN，這些環境因子能夠反映微生物群落分布，也能夠對該地區生態動態變化予以反映，但群落分布與影響因子之間的作用機理有待于進一步深入探討。