江蘇地區鯽魚造血器官壞死病風險分析

袁銳 劉訓猛 陳靜

摘要[目的]了解江蘇省鯽魚造血器官壞死病的流行情況。[方法]應用PCR方法對2015—2017年的養殖鯽魚成魚和苗種進行病原鯉皰疹病毒2型（CyHV-2）檢測，并進行風險評估。[結果]共檢測樣品265例，檢出陽性樣品32例，陽性率為12.83%，其中陽性率最高的年份陽性率高達25.00%。安徽省主要養殖鯽魚區域均具有較高感染風險，無論成魚還是苗種均可感染CyHV-2，而病原的遺傳同源性高度統一，提示江蘇地區CyHV-2未發生明顯變異。[結論]該研究可為江蘇地區鯽魚造血器官壞死病風險分析提供基本數據，并為該病的防控措施提供參考。

關鍵詞江蘇省；鯽魚造血器官壞死病；鯉皰疹病毒2型；遺傳同源性；風險分析

中圖分類號S941文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）08-0104-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.027

Abstract[Objective] To investigate the prevalence of haematopoietic necrosis of Carassius auratus in Jiangsu Province.[Method]PCR method was used to detect CyHV2 in adult and seedlings of cultured Carassius auratus from 2015 to 2017.And the risk assessment was made. [Result]265 samples were detected，among which 32 positive samples of CyHV2 were detected.CyHV2 positive rate was 12.83%，and the the positive rate was 25.00% in the year with the highest positive rate.C.auratus from main breeding areas of Jiangsu Province had greater risk of infection，both adults and seedlings could be infected with CyHV2.The genetic homology of the pathogen was highly uniform， suggesting that there was no significant variation of CyHV2 in Jiangsu Province.[Conclusion]The research could provide basic data for risk analysis of hematopoietic necrosis of C.auratus in Jiangsu Province， and provide references for the prevention and control measures of this disease.

Key wordsJiangsu Province；Haematopoietic necrosis of Carassius auratus；CyHV2；Genetic homology；Risk analysis

鯽魚造血器官壞死病是一種由鯉皰疹病毒2型（CyHV-2）引起的急性、出血性并伴有高度傳染的流行病，致死率極高[1-2]，近年來在我國內地鯽魚主養區大規模暴發流行，尤其是江蘇地區，發病區域的死亡率在50%以上，嚴重地區達90%，造成嚴重的經濟損失。該病的主要臨床癥狀為鰓出血并伴有體表和鰭基部出血[3]，發病急、死亡率高，常于春末或初秋兩季暴發，造成養殖鯽魚的大量死亡，目前已蔓延至全球多個國家和地區，遍布亞洲、北美洲、歐洲、大洋洲等[1，3-7]。

CyHV-2自2012年在我國江蘇北部鯽魚主養區被發現后一直呈現蔓延趨勢，目前江蘇、北京、武漢、廣州等地區養殖異育銀鯽體內均已檢出該病毒[8-9]。除養殖鯽魚外，我國野生鯽魚調查結果顯示湖北洪湖、安徽巢湖等地的野生鯽魚也不同程度攜帶鯉皰疹病毒2型[10]，說明該病毒在我國已經廣泛存在。目前，尚缺乏有效控制該病毒的藥物和方法，疫苗的研制被認為是防控該病的最有效方法之一。江蘇地區作為我國鯽魚的重要養殖區域，對該病進行跟蹤監測，掌握其流行規律，并對存在的主要風險點進行分析，對于疾病的防控具有重要的意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器。

病毒DNA提取試劑盒，為生工生物工程（上海）股份有限公司產品；DL 2000 DNA Marker，為寶生物工程（大連）有限公司產品；Premix TaqTM ，為寶生物工程（大連）有限公司產品；DEPC水，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；高速冷凍離心機 5417R，為Eppendor 公司產品；普通PCR儀，為Bio-Rad 公司產品；凝膠成像儀與電泳儀均為 Bio-Rad 公司產品。

1.1.2引物。參照文獻[11]中引物序列，分別合成針對鯉皰疹病毒2型聚合酶基因的1對特異性引物：Polymerase-F引物序列為5′-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3′；Polymerase-R引物序列為5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′，擴增長度均為362 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司產品合成。

1.2方法

1.2.1樣品采集與處理。

2015—2017年，在江蘇各地鯽魚養殖區域共采集265份鯽魚樣品，取樣品的鰓、腎臟、肝臟、脾臟組織保存于液氮中，帶回實驗室。若不能立即進行鯉皰疹病毒2型檢測，則需要轉移到-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2DNA提取。

參照生工生物工程（上海）股份有限公司的病毒核酸提取試劑盒說明書，提取病毒基因組DNA。取魚鰓組織或肝臟、脾臟、腎臟等組織100 mg，放入1.5 mL離心管中，用一次性研磨棒充分研磨后加入300 μL 裂解液和20 μL 蛋白酶K（20 mg/mL），充分混勻，56 ℃溫浴2 h，直到組織消化完全（如果未消化完全，需要再加入蛋白酶K繼續消化）；加入200 μL BD緩沖液，混勻，70 ℃溫浴10 min；加入300 μL無水乙醇，搖動充分混勻；將以上混合的樣品液加入小柱的小管中，室溫靜置2 min，12 000 r/min離心3 min后，去離心液；加入500 μL PW溶液，10 000 r/min離心1 min，去離心液；加入500 μL洗脫液，10 000 r/min離心1 min，去離心液；10 000 r/min離心2 min，盡量消除殘余乙醇；將小柱加入新的1.5 mL離心管中，加入30 μL 洗脫緩沖液到小柱中央，60 ℃溫浴5 min，10 000 r/min離心1 min后得到的液體即包含病毒核酸，置于-80 ℃下保存備用。

1.2.3PCR擴增與檢測。

以提取的病毒DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系（50 μL）如下：Premix TaqTM 25 μL，上、下游引物各1 μL（濃度為10 μmol/L），DNA模板為2.5 μL，加ddH2O 20.5 μL；PCR反應程序如下：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并使用凝膠成像掃描儀進行記錄。

將陽性擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠回收后，與pMD18-T載體連接過夜，連接產物轉化感受態E.coli DH5α，涂布含Amp的LB平板，挑去白色菌落，并進行菌落PCR鑒定，挑選陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4陽性序列同源性比較。使用MEGA7軟件進行陽性序列同源性比較和分析。

1.2.5風險評估。根據2015—2017年監測結果以及流行病學調查結果，分析鯽魚不同養殖階段、不同養殖模式、不同養殖區域的鯽魚造血器官壞死病流行風險；根據陽性病原的同源性分析結果，分析毒株的變異風險。

2結果與分析

2.1監測結果

2.1.12015年監測結果。

2015年在江蘇省內共采集鯽魚樣品70個，樣品主要分布如下：鹽城市24個、揚州市11個、淮安市10個、泰州市8個、南京市5個、常州市4個、鎮江市4個、徐州市4個。陽性樣品檢出的電泳結果如圖1所示，共檢出CyHV-2陽性樣品9個，陽性率為12.86%，其中江寧陽性樣品2個，寶應、句容、東臺、高港、興化、高郵、大豐各1個。這表明陽性樣品主要分布在鹽城、揚州、泰州、南京、鎮江等江蘇省鯽魚的主要養殖區域。

2.1.22016年監測結果。

2016年在江蘇省內共采集鯽魚樣品72個，樣品主要分布如下：鹽城市24個、揚州市14個、徐州市12個、淮安市10個、泰州市8個、無錫市3個、南京市1個。陽性樣品檢出的電泳結果如圖2所示，共檢出CyHV-2陽性樣品18個，陽性率達25.00%，其中大豐7個，東臺4個、射陽4個、徐州云龍區1個、銅山1個、興化1個。這表明陽性樣品主要集中在鹽城這一鯽魚養殖面積和產量最大的地區，而徐州、泰州也檢出少量陽性樣品。

2.1.32017年監測結果。2017年在江蘇省內共采集鯽魚樣品179個 ，樣品主要分布如下：鹽城市64個、淮安市31個、揚州市30個、常州市10個、徐州市8個、泰州市8個、無錫市7個，南通市6個、連云港6個、泰州市6個、宿遷市4個、南京市3個。陽性樣品檢出的電泳結果如圖3所示，共檢出CyHV-2陽性樣品7個，陽性率為3.91%，其中大豐2個，東臺2個、射陽2個、江寧1個。結果顯示，鹽城地區共檢出6個陽性樣品，南京也檢出1個陽性樣品。

2.1.4總體流行情況分析。

對江蘇省內養殖鯽魚CyHV-2進行了連續3年的跟蹤監測，共檢測樣品265個，檢出陽性樣品34個，陽性率為12.83%。其中，2015年CyHV-2陽性率為12.86%，2016年陽性率達25.00%，2017年陽性率為3.91%（圖4）。2015—2016年，養殖成魚的CyHV-2陽性率呈明顯升高的趨勢，可見CyHV-2對鯽魚成魚健康養殖的危害極大。為了探尋CyHV-2在鯽魚苗種中的攜帶情況，2017年以苗種場的監測為主，涵蓋了包括國家級良種場和省級良種場在內的各類重點苗種場，從監測結果來看，苗種的CyHV-2陽性率明顯低于成魚。這說明相對于苗種生產，鯽魚養殖過程中感染CyHV-2的風險更高。

2015—2017年CyHV-2陽性樣品主要分布在鹽城、泰州、南京、揚州、徐州、鎮江6市（表1），均為江蘇省鯽魚的主要養殖區域。其中，鹽城地區CyHV-2檢出陽性數23個，遠遠高于江蘇省其他鯽魚養殖區域，鹽城地區鯽魚異育銀鯽的養殖規模大，產量高，是江蘇省乃至全國最重要的異育銀鯽產區之一，因此CyHV-2在鹽城地區的流行對于江蘇省鯽魚養殖業的危害極大。

2.2同源性結果分析

應用MEGA軟件將測得的34個陽性序列與從GenBank數據庫中下載的CyHV-2寶應株（BY-JS1：KC841411.1）進行遺傳進化分析比較，結果見圖5。從圖5可以看出，27個陽性序列與寶應株聚在一起，7個陽性序列（均

為2015年檢出的陽性樣品）未能與寶應株聚在一起，但遺傳距離也非常小，表明2015—2017年江蘇地區檢出的CyHV-2與江蘇地區的CyHV-2代表毒株寶應株有極高的遺傳相似性，尚未發生明顯的變異。

3風險評估

3.1流行風險評估

鯽魚造血器官壞死病主要感染異育銀鯽[4-5，9-12]，一旦暴發則死亡率極高，可造成巨大的經濟損失。從2015—2016年監測結果來看，成魚感染率有明顯升高的趨勢，病原在江蘇各鯽魚主要養殖區已經普遍存在，而2017年鯽魚苗種亦檢測出陽性樣品，表明無論是苗種還是成魚都可以被CyHV-2感染。由于該病毒存在潛伏感染[13]，既可以水平傳播，又能垂直傳播[14-15]，因此無論是苗種帶毒還是成魚帶毒，鯽魚感染流行的風險極高。

目前的監測結果表明，CyHV-2只感染養殖鯽魚，對同池塘養殖的其他魚類（如草魚、青魚、鳊魚、鰱魚、鳙魚等）均不感染，查閱文獻也未見其他魚類感染CyHV-2發病的報道。精養鯽魚的塘口感染鯽魚造血器官壞死病的風險極大，近年檢出CyHV-2陽性的塘口以單養鯽魚為主，其他混養塘口則較少檢出。因此，相對于其他鯽魚養殖模式，精養鯽魚的池塘感染、流行鯽魚造血器官壞死病的風險較高，同時一旦感染發病，其經濟損失也十分巨大。

目前江蘇鯽魚養殖規模十分巨大，最主要的養殖區域為鹽城的大豐、射陽、東臺等地，此外，揚州、徐州、泰州、淮安、南京、無錫、常州等地也有不少鯽魚養殖區域。2015—2017年的CyHV-2監測結果表明，鹽城地區的感染、流行情況最為嚴重，是鯽魚造血器官壞死病感染風險最大的區域，由于鹽城地區鯽魚養殖塘口高度集約，養殖塘口集中、連片，一旦某一個養殖點感染疾病，其傳播、蔓延風險極大，容易造成巨大的經濟損失，需要重點防控。

3.2病原變異風險評估2015—2017年CyHV-2陽性序列的同源性分析結果表明，當前江蘇省的CyHV-2尚未發現明顯變異，各陽性序列與CyHV-2寶應株（BY-JS1：KC841411.1）具有極高的同源性，來源比較單一，因此毒株基因變異的風險較小，可以針對毒株盡快進行疫苗的研制。目前已有一些學者開展了相關疫苗研究工作，雖然免疫保護率還不夠理想[16-20]，但疫苗作為控制病毒病的最有效手段，未來有望通過滅活疫苗、減毒重組疫苗、基因工程疫苗等來達到防控CyHV-2的目的。

4討論

鯽魚是江蘇省最重要的養殖經濟魚類，產量超過63萬t，是我國鯽魚養殖第一大省，鯽魚因其肉質細膩、營養豐富、味道鮮美，深受我國人民喜愛，是人們餐桌上的美味佳肴。然而，隨著養殖規模的急劇擴大，各種病害頻發，經濟損失巨大，尤其是近年來最流行的鯽魚造血器官壞死病是對鯽魚養殖危害最大的傳染病。該病發病急，死亡率高，幼魚和成魚均可感染，危害極大，且流行溫度范圍較廣。目前，國內外可以對該病進行快速、準確診斷，世界各國學者從臨床診斷、流行病學、基因組學、防控手段等方面對該病展開了一定程度的研究，但關于防控方面的研究還不夠深入，防控手段較為欠缺，CyHV-2仍未能得到有效控制。因此，對該病的發生、傳播、宿主流行情況以及病原的同源性進行及時的風險分析，找出關鍵的風險點，對今后的防控措施研究奠定一個基礎是十分必要的。

該研究結果表明，CyHV-2既能感染鯽魚成魚，也能感染苗種，而苗種攜帶病毒使得后期養殖過程中的疾病感染風險巨大，因此開展苗種檢疫，及時從源頭防止病毒的傳播對于防控該病是十分重要的手段；由于目前江蘇地區該病毒的毒株來源較為單一，尚未發生明顯的變異，因此針對該病毒進行疫苗研制，將是控制該病的最有效手段。

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