促紅細胞生成素對大鼠腦缺血再灌注損傷的抑制作用

趙德福 張輝 楊文海

(錦州醫科大學附屬第三醫院神經內科，遼寧 錦州 121000)

我國腦血管病的發病率和死亡率都位居第一位，而腦血管病患者中約70%為缺血性腦血管病，后者主要的一個病理損傷就是缺血再灌注損傷〔1〕。在缺血再灌注損傷這一病理過程中，有多種發病機制參與其中，如細胞外基質的破壞、鈣超載、炎癥反應〔2〕等，這其中起到重要作用的是細胞外基質的破壞〔3〕。據報道有細胞外基質破壞作用的物質之一就是基質金屬蛋白酶(MMP)-9〔4〕，而轉化生長因子(TGF)-β1能起到修復組織損傷的功能〔5〕。本實驗，擬在腦缺血再灌注模型大鼠中以促紅細胞生成素(EPO)為干預手段，以TGF-β1和MMP-9為實驗觀測指標，探索EPO在腦缺血再灌注模型大鼠細胞外基質損傷與修復過程中的保護作用。

1 材料與方法

1.1儀器 160x連續變倍體式顯微鏡(桂林儀器廠)；CIAS-1000圖像分析儀(北京大恒圖像視覺有限公司)；LEICA-RM2135石蠟切片機(德國萊卡公司)。

1.2試藥 EPO(成都地奧制藥廠)；TGF-β1一抗及MMP-9一抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3動物 由錦州醫科大學實驗動物中心提供，90只健康SD大鼠，雄性，大鼠體重240～260 g，許可證號：SCXK(遼)2003-2007。

1.4大鼠分組與給藥 大鼠被隨機分為5組(每組18只)：假手術組、缺血再灌注組和EPO低、中、高劑量(1 000 U/kg、3 000 U/kg、5 000 U/kg，中劑量EPO取人臨床應用劑量標準)組，術前EPO 3個劑量組分別給予規定劑量的EPO腹腔注射連續3 d，每天1次，在相同條件下，缺血再灌注組和假手術組分別給予腹腔注射等量的生理鹽水。

1.5模型制備方法 大鼠大腦中動脈閉塞模型采用線栓法〔6〕。所有大鼠術前禁食禁水6 h，腹腔注射水合氯醛(濃度為3 ml/kg)麻醉，固定于手術臺，頸中略偏左切開皮膚，找到頸總動脈并手術分離，從其近心端用頸動脈夾夾住，手術剪于頸總動脈剪一切口，動脈插管插入，順動脈導管插入已處理的魚線，經頸總動脈、頸內動脈到大腦中動脈，以充分阻斷大腦中動脈的血流，然后插管撤出，皮膚縫合，魚線于血流中斷2 h撤出，血流再灌注，持續時間12 h，判定缺血再灌注模型制備成功的標準為神經功能評分〔6〕為1～3分。

1.62，3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察各組大鼠腦梗死體積 上述處理后，每組抽取大鼠6只，斷頭處死后留取腦組織，并將腦組織置于溫度為-20℃的冰箱中持續20 min，沿腦組織的冠狀面將其制成厚度為0.2 mm的腦片，將其浸入到濃度為2% 的TTC溶液，溫度為37℃的水浴持續30 min。將采集來的圖像，應用圖像處理軟件做相應處理，腦梗死體積計算方式采用文獻〔7〕的方法計算。

1.7免疫組化法觀察TGF-β1、MMP-9的表達 每組取6只大鼠，烏拉坦(5 ml/kg)麻醉，斷頭后分離海馬組織，多聚甲醛(濃度4%)固定，制備厚度約5 μm的切片，切片予脫蠟、洗滌，過氧化氫(H2O2，濃度3%)處理，用濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min，滴加TGF-β1或MMP-9一抗，孵育過夜(溫度控制4℃)，PBS洗滌3次，每次5 min，予滴加二抗，37℃孵育30 min，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，干燥，鏡下觀察。

1.8Western印跡檢測TGF-β1、MMP-9蛋白的表達 取剩余6只大鼠，麻醉斷頭取海馬組織，剪碎，加入裂解液，離心機離心，留取上清液，制備組織蛋白樣品；測定蛋白含量；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃度10%)；將組織蛋白轉移至正電荷尼龍膜上；封閉雜交；試劑盒顯色；分別分析TGF-β1蛋白和MMP-9蛋白的表達量。

1.9統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1神經功能缺損評分 假手術組神經功能正常；缺血再灌注組與假手術組相比，出現明顯的神經功能障礙，評分升高(P<0.01)；EPO 3個劑量組神經功能與缺血再灌注組相比，評分明顯降低(P<0.01)；與EPO低劑量組相比，EPO中、高劑量組神經功能障礙程度顯著減輕，評分顯著下降(P<0.05)；而EPO中劑量組神經功能與EPO高劑量組相比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2TTC染色結果 假手術組腦組織顏色紅潤，無梗死；缺血再灌注組和EPO 3個劑量組梗死區腦組織腫脹，顏色蒼白，進一步計算腦梗死體積，發現缺血再灌注組顯著高于EPO 3個劑量組(P<0.01)；與EPO低劑量組比較，EPO中、高劑量組腦梗死體積進一步減小(P<0.05)；但EPO中劑量組與EPO高劑量組間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經功能學評分及腦梗死體積比較

與假手術組比較：1)P<0.01；與缺血再灌注組比較：2)P<0.01；與EPO低劑量組比較：3)P<0.05；下表同

2.3免疫組化染色結果 觀察大鼠海馬組織CA1區，正常時MMP-9和TGF-β1主要存在于細胞胞質內，蛋白表達量少，被外界刺激因素激活后TGF-β1迅速從胞質轉移至細胞核。TGF-β1、MMP-9在假手術組細胞內極少表達。缺血再灌注組胞核內TGF-β1及胞質內MMP-9較假手術組表達明顯增多(P<0.01)。與缺血再灌注組相比，EPO 3個劑量組胞核內TGF-β1表達明顯增多，胞質內MMP-9的表達明顯減少(P<0.01)，且EPO中、高劑量組TGF-β1、MMP-9的變化較EPO低劑量組更明顯(P<0.05)。但EPO中、高劑量組間TGF-β1、MMP-9的表達無明顯差異(P>0.05)。見圖1，表2。

圖1 各組TGF-β1、MMP-9免疫組化染色結果(×400)

表2 免疫組化檢測各組大鼠TGF-β1 和MMP-9的表達

2.4Western印跡法檢測結果 TGF-β1和MMP-9蛋白在假手術組大鼠海馬區幾乎不表達。與假手術組相比，缺血再灌注組TGF-β1、MMP-9的蛋白表達明顯升高(P<0.01)。與缺血再灌注組相比，EPO 3個劑量組TGF-β1表達明顯增多，MPP-9的表達明顯降低(P<0.01)，與EPO低劑量組相比，EPO中、高劑量組TGF-β1和MPP-9表達量變化更加顯著(P<0.05)；EPO中、高劑量組間TGF-β1和MMP-9的表達無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 Western印跡檢測各組TGF-β1 和MMP-9蛋白表達

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是腦梗死發病及治療過程中的一個非常重要的病理生理過程〔8〕。腦梗死后缺血再灌注損傷的病理機制多種多樣，細胞外基質的破壞在此過程中扮演了重要角色。

降解細胞外基質的重要物質之一是MMP-9，MMP-9在正常腦組織細胞很少表達，當腦缺血再灌注時，腦組織細胞內MMP-9〔9〕表達明顯增多，MMP-9將會降解Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等細胞基底膜的成分，結果是腦內血管通透性增加，腦血腦屏障受到破壞。與MMP-9破壞細胞外基質功能相對應的是，TGF-β1具有組織損傷修復的功能〔10〕。TGF-β1的存在曾被看作是神經元存活的重要標志，其具有多種生理功能，包括促進細胞生長分化、抑制炎癥及促進組織修復等。TGF-β1在腦缺血過程中的作用近年來被逐漸重視〔11〕，腦損傷時TGF-β1的表達對腦損傷的保護和修復極其關鍵〔12〕。

EPO是臨床中各種貧血治療中的一線用藥。其在神經保護方面的作用是近年來國內外研究的熱點，結果不一，Jantzie等〔13〕的研究發現 EPO對腦損傷具有修復作用，也有研究發現EPO具有廣泛的神經保護功〔14〕，但其發揮作用的具體機制目前尚不十分明確。

本實驗結果顯示，缺血再灌注組在缺血再灌注12 h后較假手術組神經功能障礙明顯，腦梗死體積增大，海馬組織TGF-β1及MMP-9的表達升高；EPO各劑量組與缺血再灌注組比較，大鼠神經功能缺損減輕，腦梗死體積減小，海馬區TGF-β1的表達增加，MMP-9的表達下降，這一實驗結果提示，大鼠腦缺血再灌注損傷的過程中MMP-9發揮了重要作用，而 在這一過程中，TGF-β1對腦損害起到保護功能。實驗還表明，腦缺血再灌注過程中，EPO可以使MMP-9的表達減少，TGF-β1的表達增多，起到神經保護作用。EPO的劑量不同，其發揮作用的程度也不同，與EPO低劑量組相比，EPO中、高劑量組效果更明顯，EPO中、高劑量組間效果無明顯差異。在效果相同的情況下，EPO作為促進紅細胞生成藥物，高劑量組其副作用可能也會較大，因此，中劑量EPO其發揮腦保護作用可能最佳。