高鋁暴露通過(guò)PI3K信號(hào)通路致大鼠糖耐量異常的作用及機(jī)制

楊大偉 韋喜 黃慶 何明杰 王民登 吳標(biāo)良

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 百色 533000)

環(huán)境因素與糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)〔1〕。Levine等〔2〕報(bào)道,鋁元素在人體組織中蓄積到一定程度后,會(huì)增加糖尿病發(fā)生的危險(xiǎn)度,但未能進(jìn)一步闡明其機(jī)制。Obukhova等〔3〕對(duì)396例鋁廠工人定期體檢結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)鋁產(chǎn)業(yè)工人2型糖尿病的發(fā)病率較正常人群升高,并建議有必要對(duì)鋁產(chǎn)業(yè)工人實(shí)施保護(hù)措施。鋁暴露與糖耐量異常密切相關(guān)，但機(jī)制仍不清楚。本研究擬觀察高鋁暴露對(duì)大鼠糖耐量及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化，探討高鋁暴露對(duì)糖耐量異常的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 Wistar大鼠(雌雄各半)購(gòu)于右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房(CL級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào)：syxk桂2011-0010),體重250～300 g。氯化鋁粉購(gòu)自西安化工石?？挂葝u素受體底物(IRS)1抗體(ab52167)、抗胰島素受體(IR)-β抗體〔C18C4〕(ab69508)購(gòu)于ABCAM(英國(guó))，Phospho-IRS-1(Ser307)抗體#2381購(gòu)于CST1，人短效胰島素(優(yōu)泌林R)購(gòu)于禮來(lái)公司(美國(guó))。本研究符合本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2動(dòng)物分組及造模 將大鼠隨機(jī)分為高鉛暴露組和對(duì)照組，每組30只，根據(jù)參考文獻(xiàn)〔4〕，制作高鋁暴露條件。高鋁暴露組使用三氯化鋁40 mg/kg,1次/d，尾靜脈注射；對(duì)照組從尾靜脈注射生理鹽水3 ml/kg,1 次/d,同步實(shí)驗(yàn),連續(xù)注射7 d。造模過(guò)程中，對(duì)照組死亡1只(可能與注射生理鹽水速度過(guò)快有關(guān))，高鋁暴露組死亡2只(可能與注射三氯化鋁有關(guān))，已根據(jù)實(shí)驗(yàn)前設(shè)定補(bǔ)充入組，最終實(shí)驗(yàn)例數(shù)仍為每組30只。

1.3口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT) 隨機(jī)每組抽取8只大鼠，取20%的葡萄糖溶液比例按10 ml/kg將禁食12 h的大鼠經(jīng)灌胃給藥。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后0、30、60、120 min尾靜脈取血1次，約10 μl，使用羅氏血糖儀進(jìn)行血糖測(cè)定，并計(jì)算血糖曲線下面積(AUC)。葡萄糖AUC=1/4(0 min血糖 +30 min血糖)+1/4(30 min血糖 +60 min血糖)+1/2(60 min血糖+120 min血糖)。

1.4高胰島素正葡萄糖鉗夾(HECT)試驗(yàn) 隨機(jī)抽取兩組各8只大鼠，實(shí)驗(yàn)參考Kraegen等〔5〕的方法。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。將大鼠單獨(dú)置于可自由活動(dòng)小鐵籠內(nèi)，頸動(dòng)、靜脈導(dǎo)管分別與采血延長(zhǎng)管和輸液管連接，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持安靜，盡量減少環(huán)境干擾。待大鼠適應(yīng)新環(huán)境后開(kāi)始從頸動(dòng)脈導(dǎo)管采血測(cè)基礎(chǔ)血糖值和胰島素值。經(jīng)頸靜脈注射重組人胰島素(優(yōu)泌林R)10 mU/(kg·min)，每5 min取頸動(dòng)脈血測(cè)定全血血糖，如血糖低于5.0 mmol/L后開(kāi)始同時(shí)經(jīng)頸靜脈輸入20%葡萄糖溶液，繼續(xù)每5 min使用羅氏血糖儀測(cè)定血糖，并據(jù)血糖值調(diào)整葡萄糖輸注率(GIR)，將血糖維持在4.8～5.2 mmol/L,連續(xù)3次均在上述范圍時(shí)，提示鉗夾成功，進(jìn)入穩(wěn)態(tài)。以穩(wěn)定時(shí)5次GIR的平均值評(píng)價(jià)胰島素敏感性。

1.5Western印跡法測(cè)定IR-β、IRS-1及IRS-1 Ser307磷酸化蛋白 提取小鼠肝臟組織，裂解、離心、分裝以備用，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)膜，加入Western封閉液，室溫下封閉1 h，將抗IR、IRS-1、IRS-1 Ser307磷酸化及抗β-actin抗體按說(shuō)明書(shū)稀釋至合適濃度，進(jìn)行一抗孵育，4℃冰箱中搖床上過(guò)夜，加入羊抗小鼠二抗抗體，室溫下?lián)u床上孵育1 h，化學(xué)發(fā)光,顯影、定影。用高清掃描儀掃描膠片，然后使用ImageJ軟件半定量法分析目標(biāo)帶凈光密度值(以特異性條帶濃度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達(dá)水平)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1OGTT結(jié)果 與對(duì)照組相比，高鋁暴露組30、60、120 min血糖水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，AUC顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2HECT試驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組〔(11.80±1.80)mg/min〕相比，高鋁暴露組外周組織GIR〔(3.80±0.70)mg/min〕明顯降低(P<0.01)。

2.3Western印跡檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，高鋁暴露組肝臟中IR-β、IRS-1表達(dá)顯著下降，IRS-1 ser307表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表1 兩組血糖水平及AUC比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；下表同

表2 兩組肝臟組織中IR-β、IRS-1及IRS-1 Ser307的相對(duì)光密度值比較

圖1 兩組肝臟組織中IR-β、IRS-1及IRS-1 Ser307的表達(dá)

3 討 論

糖尿病早期表現(xiàn)主要為糖耐量異常，本研究表明，在高鋁暴露后，大鼠OGTT中表現(xiàn)出了糖耐量減低的情況。糖耐量異常的影響因素非常多，機(jī)制十分復(fù)雜，但其中最重要的是胰島素抵抗。

胰島素抵抗與PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。PI3K信號(hào)通路中有幾個(gè)重要組成部分：IR、IRS、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白等。IR是由位于人類(lèi)基因組19 P13.3～13.2區(qū)的基因所編碼。目前已發(fā)現(xiàn)50種以上IR的點(diǎn)狀突變或片段缺失,與嚴(yán)重的胰島素抵抗發(fā)生有關(guān)〔6〕。IRS主要包括IRS-1和IRS-2。IRS-1是一種受體信號(hào)傳導(dǎo)蛋白,主要分布在肌肉、肝臟、脂肪等胰島素敏感組織內(nèi)。IRS-1的表達(dá)不足和磷酸化的異常均可導(dǎo)致胰島素結(jié)合后不能有效地轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖,從而引起胰島素抵抗〔7,8〕。另外IRS-1磷酸化在胰島素抵抗的發(fā)生過(guò)程中起十分重要的作用。目前有研究表明〔9,10〕,2型糖尿病患者脂肪細(xì)胞InR與IRS-1的結(jié)合是正常的,但I(xiàn)RS-1的酪氨酸磷酸化水平低于正常人,而其絲氨酸磷酸化的水平會(huì)高于正常人,起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。胰島素抵抗患者骨骼肌細(xì)胞IRS-1酪氨酸磷酸化水平較正常人降低,同時(shí)IRS-1含量也下降。有研究表明,敲除IRS-1基因而保留IRS-2基因的大鼠僅出現(xiàn)胰島素抵抗,但其胰島β細(xì)胞胰島素的分泌會(huì)代償性增加,未出現(xiàn)糖尿??；而敲除IRS-2保留IRS-1的大鼠則因未出現(xiàn)β細(xì)胞的代償性分泌而更早地出現(xiàn)了糖尿病〔11，12〕。

胰島素的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要胰島素與細(xì)胞膜表面的IR結(jié)合,IR會(huì)使自身β亞基膜內(nèi)部分的酪氨酸殘基磷酸化,提高其酪氨酸蛋白激酶活性,并進(jìn)一步使其膜內(nèi)IRS-1的酪氨酸殘基磷酸化。IRS-1 Ser307的主要作用為對(duì)胰島素生物效應(yīng)起反饋調(diào)節(jié)。當(dāng)IRS-1 Ser307被磷酸化后,IRS-1酪氨酸磷酸化水平就會(huì)被抑制,胰島素信號(hào)傳導(dǎo)就會(huì)減弱,就會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗。本研究表明，高鋁暴露導(dǎo)致大鼠糖耐量異常的主要原因可能是高鋁暴露導(dǎo)致IR-β、IRS-1蛋白水平下降，影響胰島素信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)IRS-1 Ser307磷酸化的增高負(fù)反饋抑制了IRS-1的作用，從而使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，出現(xiàn)糖耐量異常。綜上，高鋁暴露可誘導(dǎo)大鼠糖耐量異常發(fā)生，其機(jī)制可能與PI3K通路受抑制有關(guān)。