胃腺癌組織中CCAR1 mRNA、蛋白表達及其意義

呂蓉蓉 齊潔敏

(承德醫學院病理教研室，河北 承德 067000)

胃癌是高發的惡性腫瘤之一，發病率在不同區域間存在較大差異，但中國的發病率依然居于世界首位〔1〕。胃腺癌是胃癌常見的一種類型，病人預后較差，死亡率也比較高，其發生、發展過程涉及多種調控機制，主要與原癌基因的異常激活、腫瘤抑制基因失活和凋亡調控基因異常表達有關〔2〕。最近發現了一種重要的細胞凋亡調控基因細胞周期和細胞凋亡調控蛋白(CCAR)1，可與多個細胞周期及細胞凋亡調控蛋白相互作用，共同調控細胞的凋亡信號，促進發生細胞凋亡或抑制細胞生長，它在細胞增殖和凋亡的調節中起重要作用〔3〕。目前國外關于CCAR1在胃癌中的表達情況鮮有報道，國內關于其在胃腺癌組織中的表達也未見報道。本實驗旨在探討胃腺癌組織中CCAR1 mRNA和蛋白的表達及其與臨床病理參數的關系。

1 資料與方法

1.1組織標本 收集在承德地區多所醫院近2年行手術治療的胃癌患者組織標本60例，后經病理診斷為胃腺癌，胃癌患者手術前均未行放化療，年齡41～85歲，高分化28例，中分化19例，低分化13例；同期選擇40例鄰近的癌旁正常胃黏膜組織(距離胃癌組織邊緣>5 cm)，包括女15例、男25例，年齡35～78歲。

1.2免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP)法檢測CCAR1蛋白 將所收集的樣品用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，以5 μm厚度連續切片。采用免疫組化SP法及二氨基聯苯胺(DAB)顯色法檢測CCAR1蛋白的表達，并按說明書進行實驗操作。CCAR1抗體購自聯科生物公司，使用濃度為1∶200。陽性對照切片使用確定具有陽性表達的切片，空白對照切片使用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗進行實驗。由兩位高年資的病理醫師通過雙盲法按照先低倍后高倍的順序在顯微鏡下觀察切片并進行診斷，每個部分隨機選擇4個高倍下視野(×400)進行統計分析，根據染色強度和陽性細胞比例來確定實驗結果。染色程度：0分為未著色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色；染色細胞所占的比例：0分為陽性細胞數<5%，1分為≥5%且<25%，2分為≥25%且<50%，3分為≥50%。將上述兩項得分相乘得到最終結果：0～1分即CCAR1蛋白陰性表達，≥2分即陽性〔4〕。

1.3Western印跡法檢測CCAR1蛋白 所收集新鮮標本長期儲存于-80℃低溫條件下，實驗時稱取約0.1 g新鮮組織，加入1 ml細胞放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液后充分研磨、裂解，提取組織中的總蛋白，并按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒的要求對所提蛋白的濃度進行檢測，取30 μg蛋白上樣量并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。內參β-actin抗體濃度為1∶3 000，兔抗人CCAR1抗體濃度為1∶1 500，4℃過夜。次日加入二抗，濃度為1∶14 000，孵育后應用電化學發光法發光液進行顯影并采集圖像。利用Image J軟件分析實驗條帶的灰度值，以靶蛋白條帶與內參條帶灰度值的比率作為靶蛋白相對表達量。

1.4實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測CCAR1 mRNA 將0.1 g組織置于已除去核糖核酸酶(RNase)的EP管中，按照說明書提取組織中的總RNA。將總RNA提取劑(TRIzol)加入新鮮組織中，放入組織研磨儀充分研磨提取組織總RNA，檢測RNA濃度并反轉錄成cDNA，進行qRT-PCR。CCAR1基因引物序列上游為5′-GCTATTCGTTGTAAGGCTCTG-3′，下游為5′-TCTCCACATGAGCTGGAACTGTA-3′。內參GAPDH的引物序列上游是5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游是5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。按照試劑盒要求將引物、cDNA等加入無酶EP管中輕彈混勻，通過qRT-PCR獲得靶基因及內參的Ct值，與正常胃黏膜相比，胃腺癌組織中靶基因表達的倍數以2-△△Ct表示。每例標本設3個復孔，重復3次試驗后取平均值。

1.5統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1CCAR1蛋白和mRNA的表達與臨床病理參數的關系 CCAR1蛋白陽性率、CCAR1蛋白和mRNA的表達與胃腺癌患者的年齡、性別和淋巴結轉移、浸潤深度、TNM分期無關(P>0.05)，與胃腺癌的分化程度有關(P<0.05)，見表1。

表1 CCAR1蛋白陽性率、蛋白和mRNA的表達與臨床病理參數的關系

1)P<0.05

2.2免疫組化SP法實驗結果 CCAR1蛋白的陽性表達主要出現在細胞核，但也可見于胞質中，在胃腺癌組織中的CCAR1蛋白陽性率〔81.6%(49/60)〕顯著高于正常胃黏膜組織〔32.5%(13/40),P<0.05〕，見圖1。

2.3Western印跡實驗結果 在胃腺癌中，CCAR1蛋白相對表達量(1.82±0.15)顯著高于鄰近的癌旁正常胃黏膜(0.50±0.09,P<0.05)，見圖2。

2.4qRT-PCR實驗結果 在胃腺癌組織中，CCAR1 mRNA的相對表達量(3.28±1.21)顯著高于正常胃黏膜(0.94±0.18,P<0.05)。

圖1 CCAR1蛋白的表達(SP法，×400)

圖2 CCAR1蛋白的表達情況

3 討 論

根據最新的統計結果顯示，我國每年新發癌癥約429萬例，占全球新發病例總數的20%，腫瘤的預防已成為我國亟待解決的重要問題〔5〕。胃腺癌的早期癥狀不典型，待其出現明顯癥狀與體征時多已屬中晚期，分化程度差，預后不佳。胃腺癌的發生是多方面因素綜合作用的結果，其發病機制涉及眾多基因和分子信號通路〔6〕，不僅涉及腫瘤細胞的異常增殖，也與細胞凋亡的抑制存在密切關系。

細胞凋亡是凋亡相關基因在某些生理和病理條件下調控的細胞主動死亡的過程。CCAR1蛋白是一種核內磷酸化蛋白，最早被發現其可以介導化療藥物引起的人類乳腺癌細胞的凋亡，它以基因特異性的方式發揮作用，并在不同的靶基因上發揮不同的作用機制〔7〕。在Wnt通路中，CCAR1可以共激活β-連環蛋白(catenin)，并協助β-catenin促進Wnt通路中的下游基因包括癌基因c-myc、細胞周期蛋白D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-7等表達；CCAR1與泛素連接酶(APC/C)亞基APC-2結合發生相互作用，并與細胞分裂周期蛋白20、上皮-鈣黏連素1共激活APC/C；而在CCAR1功能模擬物存在的情況下，CCAR1與APC-2結合受到抑制并阻止細胞進入G2/M期，促進激活Caspase泛素蛋白酶途徑，導致CyclinB1蛋白缺失，從而控制細胞的生物學活性，調控細胞的周期〔8〕。CCAR1誘導細胞凋亡，可以通過與腫瘤抑制基因P53的結合及調節周期蛋白依賴性激酶(CDK)1和細胞周期素依賴性激酶抑制因子的水平作用于轉錄調控過程，它還可以作為促凋亡信號來調節細胞周期以促進細胞的凋亡〔9〕。研究揭示了CCAR1參與多種細胞類型包括不同癌細胞的細胞增殖及凋亡信號傳導，通過與相應的細胞周期調控蛋白及細胞凋亡調控蛋白結合，來調節細胞增殖與凋亡信號，并發揮了重要作用〔10〕。Seo等〔11〕研究顯示，在前列腺癌組織中CCAR1 mRNA和蛋白與正常前列腺組織相比表達增加，其表達異常升高可引起前列腺癌細胞對凋亡產生抑制，從而導致了前列腺癌的發生；在肝細胞癌〔12〕的相關研究中發現，CCAR1蛋白在肝細胞癌中表達量增加，并促進了肝細胞癌的肝內轉移及微血管浸潤。還有研究表明在肺癌的治療過程中，CCAR1的表達量下調〔13〕，提示其表達量的升高或與肺癌的發生具有一定的關系。

本研究結果顯示CCAR1 mRNA、蛋白的相對表達量隨著胃腺癌分化程度的不斷降低均出現明顯增加。在基因水平和蛋白水平上CCAR1在胃腺癌組織中表達增高與CCAR1在其他腫瘤中的研究結果一致，說明其在胃腺癌的發生過程中具有重要的促進作用，并可能與胃腺癌的進展有關。

隨著基因組學和蛋白質組學技術發展，人們在明確腫瘤的發生和分子機制方面取得了一定的進展，對于腫瘤的治療也有一定的突破。但是，許多抗癌治療成功結果往往是短暫的，很大一部分原因是治療藥物的毒副作用及出現耐藥性癌癥。因此，有必要不斷發現腫瘤發生過程中異常表達的因子和分子途徑，以便開發新的治療策略。CCAR1 mRNA、蛋白在胃腺癌組織中表達升高，對細胞凋亡發揮了一定的抑制作用并促進了胃腺癌的發生。隨著CCAR1表達增加，胃腺癌細胞的凋亡減少，提示CCAR1在一定程度上可作為分子生物學標記來判斷胃腺癌的發生。后期可進一步研究CCAR1的表達機制，或可為胃腺癌的精確診斷及靶向治療提供新的思路。