miR-378對異體移植過程中骨髓間充質干細胞存活的影響①

葉 勖 陳明偉 高 宇 李夢潔 王 彤 邢珊珊 黃 暢 沈益民

(浙江醫院血液科，杭州 310030)

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 DMEM/F12培養基購自美國Invitrogen公司；抗體CD29-PE、CD44-FITC、CD105-FITC、CD45-PE、CD34-FITC、IgG1-FITC和IgG2a-PE均購自美國Becton Dickinson公司；一抗anti-caspase-3和anti-GAPDH 購自美國Cell signaling technology公司；二抗HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit 購自武漢三鷹生物技術有限公司；Annexin-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；噻唑藍(MTT)、二甲亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Europium標記試劑盒購自美國Abnova公司；Lipofectamine?RNAiMAX轉染試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司；miR-378 mimic、inhibitor及陰性對照由上海吉瑪制藥技術有限公司提供。

1.1.2實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠20只，鼠齡4～5周，體質量100～150 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK (湘)2013-0004，同一條件下標準飼養。

1.2方法

1.2.1rBMSCs的分離與培養 采用10%水合氯醛(500 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，無菌條件下暴露大鼠雙側股骨，使用20 ml注射器針頭在股骨兩端鉆直徑約1.5 mm的小孔，使用規格為5 ml的注射器吸取5 ml含10%FBS的DMEM/F12(1∶1)完全培養基，從股骨一端緩慢沖洗骨髓腔，另一端收集細胞懸液，縫合大鼠皮膚，術后肌肉注射慶大霉素抗菌。采用200目篩網對收集的細胞懸液進行過濾，1 500 r/min 離心5 min，吸取乳白色、云霧狀液體層，PBS重懸后再次離心，1 400 r/min離心4 min，棄上清，重復操作2次。采用DMEM/F12完全培養液重懸細胞，并接種到細胞培養瓶中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，48 h后半量換液，隨后2～3 d換液1次，待細胞達到90 %的密度時進行傳代。

1.2.2rBMSCs的鑒定 取第3代生長狀態良好的rBMSCs，制成細胞懸液(1×105個/ml)，分別加入異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)熒光標記的CD29-PE、CD44-FITC、CD105-FITC、CD45-PE、CD34-FITC和同型陰性對照IgG1-FITC和IgG2a-PE，避光冰上孵育45 min，PBS洗滌細胞3次，流式細胞儀檢測rBMSCs表面抗原CD29、CD44、CD105、CD45和CD34的表達情況。另取第……