苯佐那酯軟膠囊在中國健康受試者中的藥代動力學研究*

滿珈羽 ，焦菲菲 ，王逸雅 ，顧月清 ，舒 暢 **，丁 黎 **中國藥科大學，南京 0009；南京科利泰醫藥科技有限公司，南京 00

苯佐那酯軟膠囊具有療效好、不良反應低、無成癮性等特點，被美國胸科醫師協會推薦為治療癌癥病人咳嗽的首選藥物[1-5]。但是該藥目前尚未在中國上市，且國內外沒有關于苯佐那酯藥代動力學研究的報道，因此了解苯佐那酯軟膠囊中活性成分的濃度在中國健康受試者體內的經時變化過程對指導臨床用藥具有重大意義。再者，由于苯佐那酯是一種由15種聚合物單體組成的混合物，與代謝產物4-N-丁基氨基苯甲酸（BBA）間存在確定的量化關系。故本研究通過兩種HPLC-MS/MS法分別測定了血漿中原始BBA的濃度（方法B）和總BBA的濃度（包含原始BBA的濃度和由苯佐那酯轉化的BBA的濃度，方法A），根據總BBA濃度和原始BBA濃度的差值推算得到了血漿中苯佐那酯的濃度，并將其成功地應用于中國健康受試者單次及多次口服苯佐那酯軟膠囊后的藥代動力學研究。由于苯佐那酯會被基質中的酯酶快速水解為BBA，因此將含藥全血樣品在室溫條件下放置2小時后離心，使苯佐那酯完全轉化為BBA，以檢測血漿中總BBA的濃度。為了檢測血漿中原始BBA的濃度，必須抑制苯佐那酯的轉化，因此在含藥全血樣品中加入酯酶抑制劑甲硫酸新斯的明[6]?，F將本研究主旨予以報道。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

苯佐那酯軟膠囊 （規格：100mg/粒、200mg/粒，批號：LC-B20170503、LC-B20170501， 石藥集團恩必普藥業有限公司）；BBA對照品 （純度：99.7%，批號：2420-018A1，TLC）； 內標替米沙坦 （純度：99.6%，批號：100629-201202，中國食品藥品檢定研究院）；甲硫酸新斯的明對照品 （批號：100550-200401，中國食品藥品檢定研究院）。

甲醇、乙腈（色譜純，Merck KGaA）；甲酸、醋酸銨（ACS，Sigma-Aldrich）；試驗用水為超純水（Milli-Q制備）。

1.2 儀器與設備

島津高效液相色譜儀 （液相泵：LC-20ADXR，柱溫箱：CTO-20AC，控制器：CBM-20A Lite，脫氣機：DGU-20A5R，自動進樣器：SIL-30AC）；質譜儀（API 4000，Applied Biosystems/Sciex），質譜工作站（Analyst 1.6.2，Applied Biosystems/Sciex）；電子天平（Sartorius）；離心機（Thermo Fisher）等。

2 方 法

2.1 檢測條件

離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；離子極性：正離子；離子檢測方式：多反應監測（MRM）；碰撞氣壓力（CAD）：7Unit；氣簾氣壓力（CUR）：241.3 kPa；噴霧氣壓力 （GS1）：275.6 kPa；輔助加熱氣壓力（GS2）：275.6 kPa；離子噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550℃。BBA和替米沙坦的離子對分別為m/z194.2→138.1和m/z515.3→497.3。電參數設置見表1。

表1 BBA和替米沙坦的電參數

色譜柱：Agilent Poroshell 120 Phenyl Hexyl（2.1mm×50mm，2.7μm）； 柱溫：40℃； 流動相：含0.3%甲酸和5mmol·L-1醋酸銨的水溶液-乙腈 （60∶40）；流速：0.3mL·min-1；自動進樣器溫度：8 ℃；進樣量：10μL。

2.2 標準溶液的配制

方法A：精密稱取適量BBA對照品，用100%甲醇溶解配制成濃度為1.00mg·mL-1的BBA儲備液；用50%甲醇水溶液稀釋儲備液，配制不同濃度的BBA對照品工作溶液。精密稱取內標替米沙坦適量，用100%甲醇溶解成濃度為1.00mg·mL-1的替米沙坦儲備液；用50%甲醇水溶液稀釋，得到濃度為900ng·mL-1的內標替米沙坦工作溶液。

方法B：BBA對照品儲備液、工作溶液及內標替米沙坦儲備液的配制方式和濃度與 “方法A”一致。用50%甲醇水溶液稀釋內標替米沙坦儲備液，配制成內標工作溶液，濃度為 60.0 ng·mL-1。精密稱取適量的甲硫酸新斯的明對照品，用超純水溶解，配制成濃度為10.0mg·mL-1的甲硫酸新斯的明儲備液。

2.3 標準樣品的配制

方法A：在室溫下，按1∶19的比例將BBA的工作溶液與空白血漿混合均勻，配制BBA的標準曲線樣品和質控樣品。其中，標準曲線樣品濃度為10.0、20.0、100、500、2 500、5 000、8 000、10 000 ng·mL-1，低、中、高質控樣品的濃度為 25.0、250、7500ng·mL-1。

方法B：在冰浴條件下，按1∶19的比例將BBA的工作溶液與含甲硫酸新斯的明的空白血漿混合均勻，配制BBA的標準曲線樣品和質控樣品，濃度與“方法A”一致。此方法中含甲硫酸新斯的明的空白血漿是由含甲硫酸新斯的明儲備液的空白全血（25∶1000）離心所得。

2.4 樣品前處理

方法A：在96孔板中，加入50μL血漿樣品和30 μL 內標工作溶液（900 ng·mL-1）；渦旋 1min，向所有樣品孔中加入370μL甲醇；將密封的96孔板充分振搖 10min 后離心（10℃、4000 r·min-1，10min）；取30μL上清液加至含有570μL 40%甲醇水溶液干凈的96孔板中，渦旋混勻后進樣分析。

方法B：在冰浴條件下，向含有800μL甲醇的EP管中加入100μL血漿樣品；振搖10min后在10℃條件下以12 000 r·min-1離心10min； 取30μL上清液加至含有540μL 40%甲醇水溶液的干凈的96孔板中；并向該96孔板中加入30μL內標工作溶液（60.0 ng·mL-1），渦旋混勻后進樣分析。

2.5 藥代動力學研究

本試驗方案經過倫理委員會批準，服從《赫爾辛基宣言》中規定的倫理原則。經國家藥品監督管理局批準，臨床批件號為2016L06776。36名中國健康受試者（男女兼有），年齡18～45歲，自愿簽署知情同意書并經過嚴格的實驗室檢查合格后，平均分為 A、B、C 3 組，分別進行低（100mg）、中（200mg）、高（400mg）劑量組的單次給藥藥代動力學研究，以及中劑量組的多次給藥藥代動力學研究。

A、B組受試者在空腹狀態下分別單劑量口服1粒苯佐那酯軟膠囊 （100mg/粒、200mg/粒），C組受試者單劑量口服2粒苯佐那酯軟膠囊（200mg/粒）。于給藥前 （0 h） 和給藥后 0.167、0.333、0.5、0.667、0.833、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h 采 集 5 mL 全血。B組受試者單次給藥結束后，第2天開展多次給藥的藥代動力學試驗。連續兩天 （第2天和第3天），每天給藥3次（τ=6 h），第4天單次給藥苯佐那酯軟膠囊1粒。于第3天、第4天給藥前（0 h）和第4 天 藥 后 0.167、0.333、0.5、0.667、0.833、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h 采集 5mL 全血。 其中 2mL 推入至預冷的采血管B中（EDTA-K2抗凝且含50μL甲硫酸新斯的明儲備液），剩余3mL推入至采血管A中（EDTA-K2抗凝）。將采血管B立刻離心（10℃、4 000 r·min-1，10min）。并在冰浴條件下，取 100 μL離心得到的血漿樣品至含有800μL甲醇的EP管中，渦旋 10min 后離心（10 ℃、12 000 r·min-1，10min）獲取上清液，根據“方法B”檢測血漿中原始BBA的濃度。采血管A置于室溫條件下2 h后離心（10℃、4 000 r·min-1，10min），離心得到血漿樣品，根據“方法A”檢測血漿中總BBA的濃度?！睹绹幍洹分赋?，苯佐那酯和BBA的摩爾當量相等[7]，因此，血漿中苯佐那酯的濃度可根據公式（1）計算。隨后，采用Win-Nonlin 6.4計算BBA和苯佐那酯的藥代動力學參數。并通過WinNonlin 6.4和SPSS 19評價BBA和苯佐那酯的藥代動力學特征。

在公式（1）中，C表示濃度；MW表示相對分子質量；MW苯佐那酯=603.74；MWBBA=193.24。

3 結 果

3.1 方法學驗證[6]

方法A：此方法選擇性良好，分析物和內標間無干擾，且不存在殘留問題；在 10.0～10 000 ng·mL-1的范圍內，線性關系良好，以BBA與內標峰面積之比為縱坐標（y），以 BBC 質量濃度（c）為橫坐標，得典型的線性回歸方程為y=0.000 451 5C+0.000 270 4，r為 0.999 1；相對標準偏差（RSD）為-2.0%～1.7%，精密度≤6.0%；內標歸一化基質因子為95.6%～100.4%、回收率為86.5%～91.4%；BBA的全血樣品在室溫條件下放置3 h穩定性良好；血漿樣品在室溫條件放置18.5 h穩定性良好，-70℃條件下5次凍融循環穩定性良好，-70℃條件下長期冰凍27天、87天穩定性良好；處理后待進樣的溶液在自動進樣器（8℃）條件下放置8天穩定性良好。

方法B：此方法選擇性良好，分析物和內標間無干擾；高濃度樣品進樣后對下一針樣品的檢測不產生影響；典型的線性回歸方程為y=0.000 658 5C+0.000 190 6，r為 0.999 5；RSD 為-4.1%～2.0%， 精密度≤8.4%；內標歸一化基質因子為98.5%～109.0%、回收率為98.7%～100.8%；苯佐那酯存在條件下BBA的全血樣品和血漿樣品在冰浴條件下放置2 h穩定性良好；苯佐那酯存在條件下BBA的上清液樣品在室溫條件放置18.2 h穩定性良好，-70℃條件下4次凍融循環穩定性良好，-70℃條件下長期冰凍27天、89天穩定性良好；處理后待進樣的溶液在自動進樣器（8℃）條件下放置9天穩定性良好。

3.2 藥代動力學研究

3.2.1 單次給藥藥代動力學研究 低 （100mg）、中（200mg）、高（400mg）劑量組受試者單次口服苯佐那酯軟膠囊后，血漿中BBA和苯佐那酯的平均血藥濃度-時間曲線見圖1，主要藥代動力學參數見表2、表3。

圖1 單次給藥后血漿中BBA（A）和苯佐那酯（B）的平均血藥濃度-時間曲線

通過SPSS19對不同劑量組的Tmax進行非參數檢驗，對t1/2，CL/F和Vd/F進行單因素方差分析，結果表明劑量對BBA和苯佐那酯的藥代動力學特征均不產生影響（P＞0.05）。通過 WinNonlin 6.4，以冪函數模型法（PK=α×doseβ）對苯佐那酯的 Cmax和 AUC0-10h進行線性關系評價[8]，結果見表4。

3.2.2 多次給藥藥代動力學研究 中劑量組（200mg）受試者多次口服苯佐那酯軟膠囊后，血漿中BBA和苯佐那酯的平均血藥濃度-時間曲線見圖2，主要藥代動力學參數見表2、表3。

通過SPSS19對BBA和苯佐那酯AUC0-τ進行兩配對樣本t檢驗，結果表明，多次給藥會使BBA和苯佐那酯在體內的暴露量增加。根據蓄積常數公式計算得到 BBA 的 RCmax為 （1.20±0.45），RAUC為（1.10±0.13）； 苯佐那酯的 RCmax為 （1.24±0.57），RAUC為（1.31±0.33）。結果表明，多次給藥后BBA和苯佐那酯在體內會產生蓄積[9]。

4 討 論

基于BBA和苯佐那酯間的量化關系，本研究首次提出了間接測定法，通過測定血漿中BBA的濃度推算出了血漿中苯佐那酯的濃度。獲得了BBA及苯佐那酯在體內的經時變化過程，估算了BBA和苯佐那酯的主要藥代動力學參數，首次揭示了中國健康受試者口服苯佐那酯軟膠囊后體內苯佐那酯及其代謝產物BBA的藥代動力學特征。

表2 BBA的主要藥代動力學參數（n=12）

表3 苯佐那酯的主要藥代動力學參數（n=12）

表4 線性評價結果

圖2 多次給藥后血漿中BBA（A）和苯佐那酯（B）的平均血藥濃度-時間曲線

單次給藥試驗結果表明，在100～400mg的給藥劑量范圍內，苯佐那酯不具有線性藥代動力學特征。多次給藥200mg苯佐那酯軟膠囊后，BBA在體內的暴露量約增加9%，苯佐那酯在體內的暴露量約增加25%。且多次給藥后BBA和苯佐那酯在體內會產生蓄積。因此，在臨床連續用藥時需格外關注蓄積對藥效的影響。