PHLPP1對結直腸癌細胞生長抑制及細胞周期阻滯的作用

潘新平 劉小敏 田立

(定西市人民醫院 1腫瘤內科，甘肅 定西 743000；2手術室)

惡性腫瘤受多個癌基因、抑癌基因的調控，明確這些基因在腫瘤發生中的作用是闡明腫瘤發病機制的關鍵。結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，具有早期臨床癥狀不明顯、惡性程度高、發展速度快等特點，研究結直腸癌發病機制具有重要意義〔1〕。PHLPP1在人體的組織和器官中廣泛表達，是目前發現的一種抑癌基因，具有抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡的作用，其在卵巢癌、乳腺癌、結直腸癌等腫瘤組織中低表達，在乳腺癌等腫瘤細胞中已經證實PHLPP1具有抑制腫瘤細胞生長作用，而在結直腸癌細胞生長中的作用尚不明確〔2～5〕。本實驗首先檢測PHLPP1在結直腸癌和正常結腸上皮細胞中的表達，通過細胞轉染的方法構建上調PHLPP1的細胞株，探討PHLPP1高表達對結直腸癌細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 pcDNA3.1-PHLPP1由甘肅金域醫學檢驗研究所構建保存；Lipofectmine2000轉染試劑、RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；cDNA合成相關試劑購自立陶宛MBI Fermentas公司；熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo公司；ECL顯色試劑盒購自生工生物工程上海(股份)有限公司；活化型Caspase-9抗體、細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體購自美國Abnova公司；活化型Caspase-3抗體、細胞周期依賴性蛋白激酶(Cdk)4抗體購自美國Santa Cruz公司；PHLPP1抗體購自美國Merck millipore公司。

1.2細胞株 結直腸癌細胞HT29、Lovo、SW480和人正常結腸上皮細胞FHC購自美國ATCC，細胞常規培養于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，培養溫度為37℃，CO2濃度為5%，期間每隔2～3 d進行細胞傳代，用0.25%的胰蛋白酶消化。

1.3熒光定量PCR測定PHLPP1在結直腸癌細胞中的表達 結直腸癌細胞HT29、Lovo、SW480和人正常結腸上皮細胞FHC按照RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA，RNA用適量的DEPC水溶解以后，保存于-80℃。逆轉錄合成cDNA，體系為：2 μg總RNA、2 μl隨機引物、1 μl dNTP加水至12 μl，放在65℃孵育5 min后，置于冰上冷卻。再添加4 μl 反應緩沖液、2 μl的DTT、1 μl的RNase，置于37℃孵育2 min后，置于冰上。加入M-MLV逆轉錄酶1 μl，混合后，25℃ 10 min，37℃ 50 min，70℃ 15 min，產物保存在-20℃。取cDNA，進行熒光定量PCR，每個反應設置3個孔，40次循環，內參為GAPDH，步驟同熒光定量PCR試劑盒，測定反應管熒光強度到達閾值時的Ct值，用2-△△Ct法計算待測基因PHLPP1的表達水平。

1.4Western印跡測定PHLPP1在結直腸癌細胞中的表達 結直腸癌細胞HT29、Lovo、SW480和人正常結腸上皮細胞FHC用含有PMSF的蛋白裂解液裂解以后，在4℃離心10 min，把上清吸取至離心管中，常規BCA法對蛋白進行定量。按照每個泳道中添加20 μg蛋白進行上樣，蛋白凝膠用10%的分離膠，蛋白電泳用100 V恒壓，觀察染料進入底部邊緣，終止電泳。準備大小合適的PVDF膜，浸泡至轉膜緩沖液中10 min以后，常規方法將凝膠上的蛋白電轉移到PVDF膜，轉膜在4℃中進行，轉膜電壓為90 V。PVDF膜與待測蛋白抗體(PHLPP1抗體1∶200稀釋)室溫孵育1 h以后，再與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育2 h。滴加ECL顯色液。分析PHLPP1蛋白和內參GAPDH的灰度值，以二者的比值表示PHLPP1蛋白水平。

1.5細胞轉染 Lovo細胞按照每個孔加入105個細胞種植到6孔板，細胞密度為80%，進行細胞轉染，轉染前將細胞培養液更換成為不含血清的培養液，用Lipofectmine2000轉染試劑進行轉染，步驟同Lipofectmine2000轉染試劑說明書，把pcDNA3.1-PHLPP1和pcDNA3.1轉染至細胞中，轉染后24 h，將細胞按照1∶3的比例進行傳代以后，以500 μg/ml的G418篩選，篩選穩定轉染的細胞株。穩定轉染pcDNA3.1-PHLPP1和pcDNA3.1的細胞記為PHLPP1組和NC組，把沒有轉染的細胞作為Control組。用熒光定量PCR和Western印跡方法檢測轉染后細胞中PHLPP1表達變化，步驟同上。

1.6細胞增殖檢測 以MTT法檢測各組細胞增殖情況。取Control、NC、PHLPP1細胞，以0.25%的胰蛋白酶消化以后，用細胞培養液制成單細胞懸浮液，細胞密度為5×104個/ml，每個孔中加入100 μl的細胞懸液，將各組細胞接種到96孔板內，分別在培養1 d、2 d、3 d、4 d時各取出一個培養板，每孔添加20 μl的MTT，孵育4 h。棄上清，加150 μl的DMSO，用空白孔調零后，檢測492 nm的A值。

1.7細胞周期檢測 以PI單染法流式細胞術檢測各組細胞周期變化。取Control、NC、PHLPP1細胞，以0.25%的胰蛋白酶消化以后，收集106個細胞，用冰預冷的PBS洗滌2次，1 200 r/min離心10 min后，將PBS徹底吸除，以75%的乙醇懸浮細胞后，加入5 μl的PI染液，于避光條件孵育結合20 min。用流式細胞儀檢測細胞周期變化。同時收集各組細胞，用Western印跡方法檢測細胞中周期蛋白CyclinD1、Cdk4的表達水平，步驟同上。

1.8細胞凋亡檢測 以雙染法流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。取Control、NC、PHLPP1細胞，以0.25%的胰蛋白酶消化以后，每組細胞收集106個，添加1 ml的預冷的PBS，震蕩混合后，1 000 r/min離心10 min。用200 μl的上樣緩沖液將細胞懸浮以后，加入10 μl的Annexin V-FITC和PI，輕搖混合后，避光反應15 min。添加300 μl的上樣緩沖液，以流式細胞儀檢測細胞凋亡。同時收集各組細胞，用Western印跡方法檢測細胞中凋亡蛋白活化型Caspase-3、活化型Caspase-9的表達水平，步驟同上。

1.9統計分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1PHLPP1在結直腸癌細胞中的表達水平低于人正常結腸上皮細胞 結直腸癌細胞HT29、Lovo、SW480中PHLPP1 mRNA和蛋白水平均顯著低于人正常結腸上皮細胞FHC(P<0.05)。PHLPP1在結直腸癌細胞中低表達。見圖1和表1。

圖1 Western印跡檢測PHLPP1在各細胞中的表達

細胞PHLPP1 mRNAPHLPP1蛋白FHC1.00±0.000.78±0.09Lovo0.25±0.031)0.21±0.031)HT290.30±0.021)2)0.26±0.011)3)SW4800.48±0.061)2)3)0.32±0.031)2)3)

與FHC比較：1)P<0.05；與Lovo比較：2)P<0.05；與HT29比較：3)P<0.05

2.2pcDNA3.1-PHLPP1上調結直腸癌細胞中PHLPP1表達水平 穩定轉染pcDNA3.1-PHLPP1的結直腸癌細胞中PHLPP1的表達水平高于未做轉染和轉染對照載體pcDNA3.1的細胞(P<0.05)。成功構建了高表達PHLPP1的結直腸癌細胞株，見圖2和表2。

圖2 Western印跡檢測轉染以后結直腸癌細胞中PHLPP1表達水平

2.3PHLPP1降低結直腸癌細胞的增殖活性 高表達PHLPP1的結直腸癌細胞在培養后1 d、2 d、3 d、4 d各時間點的增殖活性均明顯低于未做轉染和轉染對照載體pcDNA3.1的細胞(P<0.05)，表明PHLPP1抑制結直腸癌細胞的增殖活性，見表3。

表2 轉染以后結直腸癌細胞中PHLPP1表達水平比較

與PHLPP1組比較：1)P<0.05；下表同

表3 各組結直腸癌細胞在培養后不同時間點A值比較

2.4PHLPP1阻滯結直腸癌細胞周期并下調CyclinD1、Cdk4蛋白表達水平 高表達PHLPP1的結直腸癌細胞G1期細胞比例均明顯高于未做轉染和轉染對照載體pcDNA3.1的細胞(P<0.05)。同時高表達PHLPP1后的結直腸癌細胞中CyclinD1、Cdk4蛋白水平降低，表明PHLPP1阻滯結直腸癌細胞周期，并下調周期蛋白CyclinD1、Cdk4的表達，見圖3和表4。

圖3 Western印跡檢測PHLPP1對結直腸癌細胞中周期蛋白CyclinD1、Cdk4表達影響

表4 各組結直腸癌細胞周期分布及CyclinD1、Cdk4表達水平比較

2.5PHLPP1誘導結直腸癌細胞凋亡并誘導細胞中活化型Caspase-3、活化型Caspase-9表達 高表達PHLPP1的結直腸癌細胞凋亡率均明顯高于未做轉染和轉染對照載體pcDNA3.1的細胞(P<0.05)，表明同時高表達PHLPP1后的結直腸癌細胞中活化型Caspase-3、活化型Caspase-9蛋白水平也升高。PHLPP1誘導結直腸癌細胞凋亡，并且可以誘導凋亡蛋白活化型Caspase-3、活化型Caspase-9的表達。見圖4和表5。

圖4 PHLPP1誘導結直腸癌細胞凋亡

組別凋亡率(%)活化型Caspase-3活化型Caspase-9Control組4.62±0.281)0.20±0.031)0.35±0.041)NC組4.86±0.421)0.21±0.051)0.34±0.031)PHLPP1組22.18±3.200.49±0.080.96±0.12

3 討 論

PHLPP是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，這類磷酸酶具有阻礙細胞內生存信號轉導的作用，在細胞生長中發揮負調控作用，其基因定位于18q21.33染色體上，其編碼的蛋白質含有亮氨酸富集區、pleckstrin同源結構域、PDZ結構域、PP2C結構域，在調控細胞生長中具有重要作用〔6～9〕。研究顯示，PHLPP1作為PHLPP的成員之一，在腫瘤組織中表達下調，在腫瘤發生中發揮抑制作用〔10〕。在結直腸癌中的研究發現，PHLPP1表達下調與腫瘤的分化程度、臨床病理參數等具有相關性〔11〕。在乳腺癌、肺癌、食管癌等中的研究表明，PHLPP1不僅可以在體外抑制癌細胞的生長，還可以在體內下調癌細胞裸鼠成瘤能力〔12～14〕。本研究顯示，PHLPP1在三株結直腸癌細胞中的表達水平均明顯低于人正常結腸上皮細胞，并且過表PHLPP1后的結直腸癌細胞的增殖能力明顯降低，這明確了PHLPP1在結直腸癌細胞增殖中的作用。

細胞周期有兩個較為關鍵的檢查點，為G1/S期和G2/M期，這兩個檢查點在受到相關因子的調節作用后可以順利地進入下一個周期，細胞周期順利進展是細胞增殖的關鍵〔15〕。在哺乳動物、酵母等生命體內已經證實，G1期決定著細胞是否可以完成的一個細胞周期，G1期是細胞DNA復制準備的關鍵時期〔16〕。細胞周期素是調控細胞周期的重要因子，其中CyclinD1在G1期合成水平較高，能夠促進細胞從G1期向S期過渡〔17,18〕。周期素依賴性激酶可以同周期素結合，其表達水平的高低隨著細胞周期進展而呈現規律性的變化，Cdk4在G1期同Cyclin結合促進細胞周期進展〔19〕。最近的研究顯示，PHLPP1能夠將細胞髓系白血病細胞周期阻滯在G1期，這可能是其抑制白血病細胞生長的原因之一〔20〕。本實驗結果顯示，PHLPP1同樣可以阻礙結直腸癌細胞從G1期向S期過渡，并且可以下調Cdk4、Cyclin D1蛋白的表達，提示PHLPP1可能通過阻礙細胞周期進展下調結直腸癌細胞增殖能力。

腫瘤的發生和發展除了與腫瘤細胞惡性增殖有關以外，還與腫瘤細胞凋亡減少有關，腫瘤細胞的凋亡受到細胞內多種基因的共同調控作用，其中Caspase凋亡反應是細胞凋亡發生的主要原因，Caspase-3和Caspase-9作為該凋亡反應的執行因子和起始因子在凋亡過程中發揮標志性作用〔21～23〕。目前在肺癌、胃癌等腫瘤中發現，上調PHLPP1的表達可以激活細胞內Caspase凋亡反應，這可能是PHLPP1誘導細胞凋亡的機制之一〔24,25〕。本實驗證實，上調PHLPP1后的結直腸癌細胞中Caspase-3和Caspase-9活化程度升高，細胞凋亡率也升高，提示PHLPP1可以激活Caspase凋亡反應誘導結直腸癌細胞凋亡。