重組RPLP0蛋白的表達、鑒定及評價①

盧小嵐 王 強 杜 琴 梁 騎 羅文依③ 王舒琪③ 張國元 劉劍平 王東生

(川北醫學院附屬醫院檢驗科，南充 637000)

核糖體磷蛋白大亞基P0(Ribosomal phospho-protein large P0,RPLP0)蛋白是核糖體大亞基上的一個重要組成部分，參與蛋白質合成過程的調節，對核糖體的穩定和活性起關鍵作用[1]。此外，RPLP0蛋白還與系統性紅斑狼瘡、細胞凋亡、腫瘤的發生發展密切相關[2,3]。His6是6個組氨酸殘基組成的融合標簽，能構成獨特的結構特征利于純化和檢測。GST是一種能促進蛋白表達和溶解的標簽蛋白。本研究擬采用基于PCR的基因拼裝(PCR based gene assembly)技術[4]，在RPLP0基因N端引入GST標簽，C端引入His6標簽，以期獲得具有可溶性易純化性的融合蛋白。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗試劑 PET41a質粒購自Novagen公司；限制性內切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA 連接酶、高保真聚合酶和誘導劑IPTG均購自日本TaKaRa公司；OverExpress C41(DE3)菌種、DNA ladder、質粒提取試劑盒購自北京天根公司；胰蛋白胨和酵母粉購自美國Sigma公司；卡那霉素和氯霉素購自美國Gibco公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自日本TOYOBO公司；引物合成及DNA測序委托上海生工公司完成；HRP標記羊抗小鼠抗體、HRP標記羊抗人IgG抗體購自美國Abcam公司；WB所用重組RPLP0蛋白購自Diarect公司；其余試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.1.2實驗對象 收集川北醫學院附屬醫院2016年1月～2017年12月期間經歐蒙免疫印跡法(LIA)檢出的抗核糖體P蛋白抗體陽性患者的血清110例。收集經歐蒙免疫印跡法檢測抗U1-nRNP、SmD1、SS-A、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP-B、PCNA、dsDNA、NUC和AMA M2陽性不同自身抗體的血清樣本各6份。

1.2方法

1.2.1PCR擴增 根據Genbank中RPLP0基因編碼序列設計一對PCR引物，并在引物的5′端分別引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位點；引物為：P1：5′-agggatccatgcccagggaagacagg-3′；……