瑞舒伐他汀對(duì)CVB3誘導(dǎo)小鼠病毒性心肌炎的保護(hù)作用①

朱 雯 趙 錦

(山東省淄博市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，淄博 255200)

心肌炎是指感染、物理、化學(xué)因素或自身免疫病引起的心肌炎癥性病變，病毒性感染是最常見(jiàn)病因[1]。癥狀包括心率不齊、運(yùn)動(dòng)能力下降、呼吸急促和胸部疼痛，由于擴(kuò)張性心肌病和心臟驟停引起心力衰竭[2]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多種病毒可引起心肌炎，其中以柯薩奇病毒最為常見(jiàn)[3]。心肌炎的診斷方法包括心電圖、肌鈣蛋白、核磁成像和心臟超聲。目前心肌炎缺少特異的治療措施，以輔助治療和限制體力活動(dòng)為主，常用的藥物有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β受體阻滯藥和利尿劑[4,5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年全年約有150萬(wàn)人診斷為急性心肌炎，其中男性患者數(shù)量居多[6]。瑞舒伐他汀是臨床上常用的調(diào)節(jié)血脂的藥物，能選擇性地抑制肝臟中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaric coenzyme A，HMG-COA)還原酶，使低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯顯著降低，且降脂效果優(yōu)于同類藥物[7]。研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀具有改善血管內(nèi)皮穩(wěn)定、抗氧化、抗炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的作用[8,9]。近來(lái)有報(bào)道顯示，瑞舒伐他汀具有心肌保護(hù)作用，抑制自身免疫引起的心肌炎癥[10]，但瑞舒伐他汀對(duì)病毒性心肌炎的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以病毒性心肌炎小鼠為模型，研究瑞舒伐他汀對(duì)病毒性心肌炎的保護(hù)作用及相關(guān)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 BALB/c雄性小鼠，4～6周齡，體重16～18 g，購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。瑞舒伐他汀為阿斯利康制藥有限公司產(chǎn)品。HE染色試劑盒、TUNEL染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物；肌紅蛋白(Myoglobin,Mb)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)和肌鈣蛋白1(Cardiac troponin 1,cTn1)和白細(xì)胞介素(Interleukin 6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海邦奕生物科技有限公司；小鼠TNF-α ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自艾美捷科技有限公司。柯薩奇B3病毒(Coxsackie virus B3，CVB3)來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院昆明病毒所。

1.2方法

1.2.1CVB3病毒擴(kuò)增和滴度檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，接種于6孔板，待覆蓋面積達(dá)80%以上時(shí)，加CVB3病毒原液，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。2 000 r/min離心10 min，收集上清液。采用Reed-Muench法做滴度測(cè)定，細(xì)胞接種于96孔板，病毒懸液用梯度稀釋法稀釋成10-10～10-1噬菌斑形成單位(Plaque forming unit，PFU)后，加病毒懸液至相應(yīng)細(xì)胞孔，設(shè)置空白組和對(duì)照組，培養(yǎng)72 h后，檢測(cè)細(xì)胞病變，以50%的病變細(xì)胞為判斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50% tissue culture infective dose,TCID50)。

1.2.2小鼠分組及模型的建立 將32只BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、瑞舒伐他汀組、CVB3誘導(dǎo)組和CVB3+瑞舒伐他汀組，每組8只。CVB3誘導(dǎo)組和CVB3+瑞舒伐他汀組小鼠腹腔注射 0.5 ml TCID50的CVB3病毒液。瑞舒伐他汀組和CVB3+瑞舒伐他汀組小鼠腹腔注射5 mg/kg BW 的瑞舒伐他汀，每天1次，連續(xù)注射12 d。

1.2.3HE染色 小鼠處死前，真空采血管取血。剪開(kāi)右心耳，生理鹽水沖洗，多聚甲醛灌注100 ml。乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色10 min，自來(lái)水洗，鹽酸乙醇分色，水洗返藍(lán)，70%乙醇處理5 min，80%乙醇處理5 min，伊紅液染色20 s，95%乙醇5 min，無(wú)水乙醇5 min，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.4TUNEL染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗5 min，加蛋白酶K室溫下水解20 min；蒸餾水洗，3%過(guò)氧化氫室溫下反應(yīng)5 min，PBS洗2次；加TdT緩沖液，室溫5 min，吸干后加TdT反應(yīng)液，濕盒中37℃反應(yīng)1 h；加反應(yīng)終止液，37℃反應(yīng)30 min；PBS洗3次，加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體，濕盒中室溫孵育30 min；PBS洗3次，加顯色液，室溫反應(yīng)5 min。蒸餾水洗，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，用Image-pro plus軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。

1.2.5心臟功能指標(biāo)檢測(cè) 小鼠感染CVB3病毒第12天后，進(jìn)行心臟功能檢測(cè)，術(shù)前禁食不禁水4 h。小鼠腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，仰臥位固定。備皮，沿頸部剪開(kāi)皮膚，分離氣管，插入連接呼吸機(jī)的導(dǎo)管。分離右頸總動(dòng)脈，將微導(dǎo)管經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入升主動(dòng)脈及左心室。多道生理放大器和記錄儀測(cè)量左心室收縮壓峰值，動(dòng)脈導(dǎo)管記錄平均動(dòng)脈壓和心率。

1.2.6ELISA測(cè)定 將采取的血液樣品于室溫靜置2 h，使血清析出，4℃離心機(jī)中2 500 r/min離心10 min后，取上清，生理鹽水稀釋后備用。取100 μl樣品至反應(yīng)孔，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)樣品孔和空白孔，加檢測(cè)抗體，37℃孵育90 min，洗滌液洗5次，加生物素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，37℃溫育30 min，洗滌液洗5次；加顯色液，37℃避光反應(yīng)15 min，加終止液，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處吸收值。每個(gè)標(biāo)本測(cè)3個(gè)復(fù)孔，測(cè)定值為3個(gè)復(fù)孔的平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1瑞舒伐他汀緩解CVB3誘導(dǎo)的小鼠心肌組織損傷 對(duì)照組和瑞舒伐他汀組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列規(guī)則，橫紋整齊，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)；CVB3誘導(dǎo)組心外膜充血，心肌組織出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間隙變大，出現(xiàn)空泡(圖1)。CVB3+瑞舒伐他汀組，心肌組織病理?yè)p傷明顯減輕(圖1)。表明瑞舒伐他汀可以緩解CVB3誘導(dǎo)的小鼠心肌組織損傷。

2.2瑞舒伐他汀抑制CVB3誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡 TUNEL染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和瑞舒伐他汀組相比，凋亡陽(yáng)性心肌細(xì)胞的比率沒(méi)有明顯變化(P>0.05，圖2)。CVB3誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比，凋亡細(xì)胞的比率顯著上升，提示CVB3誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.05，圖2)。CVB3+瑞舒伐他汀組與CVB3誘導(dǎo)組相比，凋亡細(xì)胞比率顯著下降(P<0.05，圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瑞舒伐他汀抑制CVB3誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡。

2.3瑞舒伐他汀對(duì)心肌炎小鼠心臟功能的影響 瑞舒伐他汀組與對(duì)照組相比，平均動(dòng)脈壓(Mean arterial pressure，MAP)、心率(Heart rat，HR)、左心室收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)均沒(méi)有顯著變化(P>0.05，圖3)。CVB3誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比，MAP、HR和LVSP顯著降低(P<0.05，圖3)。CVB3誘導(dǎo)的心肌炎小鼠經(jīng)瑞舒伐他汀加藥后，MAP、HR和LVSP顯著升高(P<0.05，圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瑞舒伐他汀改善CVB3誘導(dǎo)心肌炎小鼠的心臟功能。

2.4瑞舒伐他汀對(duì)心肌炎小鼠心肌酶的影響 瑞舒伐他汀組與對(duì)照組相比，Mb、CK-MB和cTn1的含量差異沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。CVB3誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比，Mb、CK-MB和cTn1的含量顯著上升(P<0.05，圖4)；CVB3+瑞舒伐他汀組與CVB3組相比，Mb、CK-MB和cTn1的含量顯著降低(P<0.05，圖4)。結(jié)果表明，瑞舒伐他汀緩解CVB3誘導(dǎo)的小鼠心肌壞死。

圖1 HE染色觀察心肌組織病理?yè)p傷(×400)Fig.1 HE staining was used to observe pathological injury of cardiac tissue(×400)

圖2 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況(×400)

Fig.2 TUNEL staining was used to detect apoptosis conditio

Note: Compared with the Ctrl group，*.P<0.05；compared with the CVB3 group，#.P<0.05.

2.5瑞舒伐他汀抑制CVB3誘導(dǎo)的小鼠心肌炎性反應(yīng) ELISA檢測(cè)心肌組織中炎癥因子的含量，瑞舒伐他汀組與對(duì)照組相比，TNF-α和IL-6的含量差異沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖5)。CVB3組與對(duì)照組相比，TNF-α和IL-6的含量顯著上升，提示CVB3誘導(dǎo)小鼠發(fā)生炎性反應(yīng)(P<0.05，圖5)。CVB3+瑞舒伐他汀組與CVB3組相比，TNF-α和IL-6的含量顯著降低(P<0.05，圖5)，表明瑞舒伐他汀抑制CVB3誘導(dǎo)的小鼠心肌炎性反應(yīng)。

圖3 心臟功能指標(biāo)的檢測(cè)Fig.3 Detection of cardiac function indicatorsNote: Compared with the Ctrl group，*.P<0.05；compared with the CVB3 group,#.P<0.05.

圖4 血液中心肌酶的檢測(cè)Fig.4 Detection levels of myocardial enzymesNote: Compared with the Ctrl group,*.P<0.05；compared with the CVB3 group,#.P<0.05.

圖5 ELISA檢測(cè)炎癥因子的含量Fig.5 Concentration of inflammatory factors were detec-ted by ELISANote: Compared with the Ctrl group,*.P<0.05；compared with the CVB3 group,#.P<0.05.

3 討論

病毒性心肌炎是常見(jiàn)的心血管疾病，是引起兒童和年輕成年人猝死的重要原因。目前病毒性心肌炎的確切機(jī)制并不清楚，心肌炎缺少特異的治療藥物，治療方案以減少心肌負(fù)擔(dān)、改善心肌營(yíng)養(yǎng)和消除炎癥為主。柯薩奇病毒是無(wú)包膜的單鏈RNA病毒，在消化系統(tǒng)中復(fù)制，由呼吸系統(tǒng)和糞便傳播[11]。柯薩奇病毒產(chǎn)生溶細(xì)胞毒素使心肌受損，以CVB3的致病性最強(qiáng)[12]。本文以CVB3感染BALB/c小鼠建立病毒性心肌炎模型，探索瑞舒伐他汀對(duì)病毒性心肌炎的保護(hù)作用。

病毒性心肌炎常造成局限性和彌散性的心肌組織壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。CVB3組與對(duì)照組相比，心肌組織出現(xiàn)明顯的病理變化，表明病毒性心肌炎模型建模成功。由于瑞舒伐他汀具有降脂和心血管功能調(diào)節(jié)能力，在許多疾病中均表現(xiàn)出器官保護(hù)作用，如為易中風(fēng)的大鼠提供終末器官保護(hù)作用，對(duì)慢性腎病患者具有保護(hù)作用[13]。瑞舒伐他汀治療病毒性心肌炎小鼠后，小鼠心肌組織病理?yè)p傷明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瑞舒伐他汀能緩解CVB3病毒引起的BALB/c小鼠心肌組織病理?yè)p傷。

細(xì)胞凋亡在機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育等各個(gè)階段均發(fā)揮著重要的作用。病毒感染后，導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，同時(shí)激活Fas通路、Bcl-2家族和Caspase家族，啟動(dòng)心肌細(xì)胞凋亡[14]。病毒感染造成心肌細(xì)胞死亡是導(dǎo)致心肌炎患者心臟功能減退的主要原因。大量報(bào)道證實(shí)，瑞舒伐他汀能抑制細(xì)胞自噬，如Nam等[15]發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀能緩解環(huán)孢霉素誘導(dǎo)腎病大鼠模型的炎癥和凋亡。鮑曉梅等[16]實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，瑞舒伐他汀抑制高半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀加藥后的病毒性心肌炎小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，表明瑞舒伐他汀抑制CVB3誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡。

心肌肌鈣蛋白是調(diào)節(jié)肌肉收縮的亞單位，以復(fù)合物或游離狀態(tài)存在于心肌細(xì)胞中，正常情況下不會(huì)在血液中出現(xiàn)。當(dāng)心肌受損時(shí)，心肌肌鈣蛋白被釋放到血液循環(huán)中，因此將心肌肌鈣蛋白作為心肌損傷的特異性標(biāo)志物[17]。CK-MB是心肌受損的早期指標(biāo)[18]。肌紅蛋白具有貯存和運(yùn)輸氧的功能，心肌損傷時(shí)，血液中的肌紅蛋白迅速升高[19]。余波等[20]發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者服用瑞舒伐他汀后，血清中cTn1和CK-MB的含量顯著降低。本研究ELISA測(cè)定結(jié)果顯示，加藥處理后的心肌炎小鼠，血液中心肌酶的含量均不同程度地降低。結(jié)果表明，瑞舒伐他汀緩解CVB3對(duì)小鼠心肌組織的損傷。

TNF-α是巨噬細(xì)胞分泌的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，能激活炎癥細(xì)胞參與炎性反應(yīng)，介導(dǎo)免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，病毒性心肌炎患者血清中和心肌中TNF-α的水平升高，提示TNF-α與病毒性心肌炎相關(guān)[21]。IL-6是機(jī)體應(yīng)對(duì)感染和組織損傷產(chǎn)生的重要介質(zhì)，參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)[22]。大量研究證實(shí)，瑞舒伐他汀具有抗炎性反應(yīng)的作用，如Gianella等[23]研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀預(yù)防中風(fēng)大鼠的腎臟炎性反應(yīng)和纖維化。Kim等[24]實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，瑞舒伐他汀能降低內(nèi)皮細(xì)胞中IL-6的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)。本文ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀加藥后，心肌炎小鼠的心肌組織中IL-6和TNF-α的含量顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究一致，表明瑞舒伐他汀抑制心肌炎小鼠的炎性反應(yīng)。

綜上所述，本文以柯薩奇病毒感染BALB/c小鼠，建立心肌炎小鼠模型，模型小鼠經(jīng)瑞舒伐他汀加藥后，心肌組織的病理?yè)p傷減輕，炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡得到有效的抑制；心臟功能有效緩解。瑞舒伐他汀抑制炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制還有待研究。