固相萃取-HPLC法同時測定鹽酸帕洛諾司瓊注射液中6種雜質(zhì)

杜有國 ，王張權(quán) ，孫 平 ，李 飛 南京醫(yī)科大學，南京 6；江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司，南京

鹽酸帕洛諾司瓊，化學名稱為（3a S）-2-[（S）-1-氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛-3-基]-2，3，3a，4，5，6-六氫-1-酮-1H苯[并]異喹啉鹽酸鹽，是一種親和力較強的5-HT3受體選擇性拮抗型止吐劑，美國綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)的臨床指南已推薦鹽酸帕洛諾司瓊注射液作為首選藥物，用于預(yù)防高度致吐化療引起的急性惡心、嘔吐及預(yù)防中度致吐化療引起的惡心、嘔吐。

鹽酸帕洛諾司瓊注射液由瑞士MgiPharma Inc.及其合作伙伴Hnelsinn Healthcare Sa研制開發(fā)，并于2003年7月25日首先在美國獲準上市，規(guī)格為5mL∶0.25mg。鹽酸帕洛諾司瓊原料藥已被《美國藥典》收載，并對其雜質(zhì) A、B、C、D、E 和對映異構(gòu)體進行了控制。鹽酸帕洛諾司瓊注射液及其他劑型均未被國內(nèi)外藥典收載。

目前鹽酸帕洛諾司瓊注射液有關(guān)物質(zhì)特定雜質(zhì)檢測方法主要包括液相色譜直接測定[1]、有機溶劑提取濃縮后液相色譜檢測[2]、干燥蒸發(fā)濃縮后液相色譜檢測[3]等。

這些方法存在的問題包括大量的輔料影響色譜柱壽命，多次有機溶劑提取富集對人員操作要求高、對環(huán)境有污染，方法不能同時對樣品中可能存在的雜質(zhì)A、B、C、D、E和對映異構(gòu)體進行一次性檢測等[1-8]。本文利用固相萃取小柱（SPE），通過調(diào)節(jié)鹽酸帕洛諾司瓊注射液的pH、選擇洗脫溫度、優(yōu)化洗脫溶劑等去除樣品中輔料，富集樣品中待測雜質(zhì)A～E、對映異構(gòu)體和主成分，實現(xiàn)了在不使用大量有機溶劑的情況下，同時檢測鹽酸帕洛諾司瓊注射液中雜質(zhì)A～E和對映異構(gòu)體。本方法顯著提高了分析效率和穩(wěn)定性，具有簡捷、經(jīng)濟、綠色和高效的特點。

1 實驗部分

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀；CPA225D電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；Milli-Q超純水機（默克密理博公司）。

1.2 藥品與試劑

對照品：鹽酸帕洛諾司瓊 （純度99.7%，批號101030-201703，中國食品藥品檢定研究院）；雜質(zhì)B（純度 100%，批號 F02770，USP）；雜質(zhì) C（純度 96.4%，批號S17042409-2，江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司）；雜質(zhì)D（純度 88%，批號 F02790，USP）；雜質(zhì) E（純度 100%，批號 F027A0，USP）；對映異構(gòu)體（批號 F027B0，純度100%，USP），各結(jié)構(gòu)式見圖1。鹽酸帕洛諾司瓊注射液（批號 20180801、20180802、20180803，規(guī)格5mL∶0.25mg，江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司）；乙腈、四氫呋喃為色譜純，其他試劑為分析純；純化水。

圖1 鹽酸帕洛諾司瓊及各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件 分析柱：Astec CHIROBIOTIC?V（250mm ×4.6mm，5μm）；流動相：四氫呋喃-20mmol·L-1醋酸銨（冰乙酸調(diào) pH 6.0）=10∶90；柱溫：35 ℃；流速：1.5mL·min-1；檢測波長：238 nm；進樣量：100μL。

1.3.2 樣品前處理 取本品6瓶，合并搖勻，精密量取27mL置適當容器中，精密加入1mol·L-1氫氧化鈉溶液 1mL，混勻，取該溶液 15mL，置 Agilent Bond Elut C8（200mg，3mL）固相萃取小柱上，通過重力使溶液經(jīng)過小柱富集，再依次用1.5mL純水、1.0mL 溶劑 A[乙腈-水-三氟乙酸（280∶720∶0.67）]對萃取小柱進行洗脫，棄除洗脫液。最后用1mL無水乙醇洗脫小柱，收集無水乙醇洗脫液置2mL量瓶中，用0.02mol·L-1醋酸銨溶液（冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.0）稀釋，定容至刻度，置4℃冰箱中冷藏約10min，過濾，取此濾液作為供試品溶液，上機檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 富集溶液pH選擇

鹽酸帕洛諾司瓊注射液pH約為5，直接使用SPE小柱富集，各雜質(zhì)和主成分在富集時即損失。參考各組分結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)樣品溶液pH至堿性，改變各組分在SPE柱上的保留，實現(xiàn)輔料去除，待測組分保留。實驗考察了樣品在pH 5～11.5各組分的保留情況。結(jié)果表明，樣品溶液pH調(diào)節(jié)為10.0～11.5，濾液中除輔料外，均未檢出待測各組分，故最終樣品溶液pH設(shè)定為11.0。

為了實驗的簡捷性和可操作性，考察了樣品pH與樣品中加入氫氧化鈉溶液的濃度和體積關(guān)系。結(jié)果表明，精密量取樣品27mL，加入1mol·L-1氫氧化鈉溶液1mL，混勻，即可得到所需pH的富集溶液。

2.2 富集溫度選擇

洗脫溫度可能會對固相萃取小柱的選擇性產(chǎn)生影響。實驗考察了洗脫溫度為4℃、15℃、20℃、35℃時洗脫能力。結(jié)果表明，各溫度下，洗脫液中均無待測組分被洗脫，故最終洗脫溫度選擇室溫。

2.3 洗脫溶劑選擇

樣品經(jīng)固相萃取小柱富集后，需使用合適的溶劑洗脫萃取小柱中殘留的輔料，收集富集物。實驗考察了不同體積水對固相萃取小柱中輔料的洗脫能力。結(jié)果表明，經(jīng)過1.5mL水洗脫后，萃取小柱中輔料已經(jīng)基本洗脫完全。

固相萃取小柱富集樣品后呈現(xiàn)堿性，如需使用小體積溶劑將待測組分洗脫出來，需對SPE柱進行酸化處理。實驗考察了不同體積、不同比例的水-20mmol·L-1醋酸銨、水-三氟乙酸、乙腈-水-三氟乙酸等對SPE柱進行酸化。結(jié)果表明，使用洗脫劑乙腈-水-三氟乙酸（280∶720∶0.67）以 0.8mL、1.0mL、1.2mL對固相萃取小柱洗脫，洗脫液中均無待測組分洗脫出來，當1.5mL洗脫液時，組分開始損失，故選擇用洗脫液乙腈-水-三氟乙酸 （280∶720∶0.67）以1.0mL對SPE柱進行洗脫。

為了達到檢測靈敏度，需使用少量溶劑對各組分進行富集。實驗分別考察了甲醇、乙腈、無水乙醇等液相常用溶劑作為富集溶劑時各組分的富集情況。結(jié)果表明，在富集溶劑體積允許的范圍內(nèi)，甲醇、乙腈不能將所有待測組分全部洗脫，無水乙醇能夠?qū)⒋郎y各組分進行全部富集，最終選用1mL無水乙醇作為富集溶劑。

2.4 洗脫液處理

使用無水乙醇富集待測組分后，由于溶劑效應(yīng)，色譜圖中出峰較早的組分峰形較差。故結(jié)合HPLC流動相組成和待測組分所需靈敏度，選擇將富集溶液用0.02mol·L-1醋酸銨溶液（冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.0）稀釋1倍，并且在4℃冰箱中冷藏約10min，過濾，進一步去除殘留的微量輔料作為供試品。

2.5 分析方法的評價驗證

2.5.1 專屬性實驗 取雜質(zhì)A～E、對映異構(gòu)體、鹽酸帕洛諾司瓊對照品適量，用乙醇-0.02mol·L-1醋酸銨溶液（冰醋酸調(diào)節(jié) pH 值至 6.0，50∶50）溶解，稀釋制成約含各雜質(zhì)2μg·mL-1、帕洛諾司瓊0.4mg·mL-1的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液；取空白輔料溶液，按照“1.3.2”樣品前處理方法處理，作為空白輔料檢測溶液。精密量取上述溶液，按照“1.3.1”色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白輔料無干擾，各雜質(zhì)均可被檢出，分離度良好。表1為分離度測定結(jié)果，圖2為系統(tǒng)適用性圖譜。

表1 各組分分離度

圖2 鹽酸帕洛諾司瓊注射液系統(tǒng)適用性色圖譜

2.5.2 線性及范圍 分別精密稱量各雜質(zhì)對照品，用適當乙醇-0.02mol·L-1醋酸銨溶液 （冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，50∶50）溶解，稀釋制成混合對照品溶液；精密量取一定體積的混合對照品溶液，用溶劑稀釋制成每毫升中約含各雜質(zhì) 0.2、0.4、0.8、2.1、4.3 μg的系列混合對照品溶液，按照“1.3.1”色譜條件進樣檢測，以目標物的濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（Y，mAU*s）為縱坐標進行線性回歸，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 各雜質(zhì)線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）及線性范圍

由表 2 可知，在 0.2～4.3μg·mL-1線性范圍內(nèi)，6個雜質(zhì)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 5。

2.5.3 檢測限和定量限 取已知濃度的 “線性溶液”逐級稀釋，測定的信號與空白處的信號（信噪比）進行比較，當信噪比為10∶1，且重復(fù)6次進樣精密度的相對標準偏差（RSD）不大于10%時，確定此濃度為定量限，將信噪比為3∶1的濃度作為檢測限濃度，結(jié)果見表3。

表3 各雜質(zhì)檢測限和定量下限（n=6）

由表3可見，該方法中各待測雜質(zhì)的檢測限為0.056～0.065 μg·mL-1，定量限為 0.19～0.22 μg·mL-1，約為供試品濃度的0.05%。

2.5.4 方法的回收率 精密量取鹽酸帕洛諾司瓊注射液27mL，精密加入1mol·L-1的氫氧化鈉溶液1mL，搖勻，精密量取上述溶液15mL，平行配制9份，分為3組，每組3份。每組中分別精密加入一定體積、適量濃度的各雜質(zhì)對照品溶液，制成含各雜質(zhì)限度濃度50%、100%、150%溶液，作回收率測定。按照“1.3.2”樣品前處理方法處理檢測。見表4。

表4 各雜質(zhì)加樣回收率試驗結(jié)果（n=9/3）

由表4可見，在低、中、高三個濃度水平下，方法的回收率為90.60%～105.7%。說明該方法準確度高。

2.5.5 方法的重復(fù)性 精密量取鹽酸帕洛諾司瓊注射液27mL，加入1mol·L-1的氫氧化鈉溶液1mL，搖勻，精密量取該溶液15mL，平行配制6份。每組中分別精密加入一定體積、適量濃度的雜質(zhì)對照品溶液，制成含各雜質(zhì)限度濃度100%的溶液。按照“1.3.2”樣品前處理方法處理檢測，見表5。

表5 重復(fù)性試驗結(jié)果

由表5可見，6份樣品中各雜質(zhì)RSD均小于6%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.6 樣品檢測

取3批鹽酸帕洛諾司瓊注射液作為供試品溶液，按照“1.3.2”樣品前處理方法及“1.3.1”色譜條件進樣測定，樣品中各雜質(zhì)檢測結(jié)果見表6。

表6 樣品中各雜質(zhì)測定結(jié)果

3 結(jié) 論

本實驗建立了固相萃取-高效液相色譜法測定鹽酸帕洛諾司瓊注射液中6種已知雜質(zhì)的分析方法。通過固相萃取去除樣品中輔料，富集待測組分，實現(xiàn)了在不使用大量有機溶劑的條件下，同時檢測樣品中6種雜質(zhì)。該方法驗證結(jié)果表明，本法可獲得很好的精密度、靈敏度和準確度，可用于同時測定鹽酸帕洛諾司瓊注射液中6種雜質(zhì)。