高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖對小鼠精子線粒體及活動力損傷的機(jī)制研究

彭媛紅 敬 佳 胡燕琴 劉 悅 丁之德

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)與遺傳發(fā)育學(xué)系；上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海 350001）

肥胖是一種代謝疾病，其影響因素有很多，包括機(jī)體是否適當(dāng)運(yùn)動、生活方式（食物的種類和攝入量）、環(huán)境以及遺傳因素等[1]。近幾十年來，肥胖以其日益增加的流行性和與多種慢性疾病的相關(guān)性成為世界范圍內(nèi)的一個主要健康問題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2018年的報(bào)告顯示，截止到2016年，世界范圍內(nèi)18歲及以上成年人中有超過19億的超質(zhì)量[體質(zhì)量指數(shù)（body mass index,BMI）≥25]人口，其中有超過6.5億的肥胖人群（BMI≥30）[2]。我國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會頒布的成人體質(zhì)量判定，將24≤BMI＜28定義為超質(zhì)量，28≤BMI定義為肥胖[3]，從1975年到2014年，我國肥胖人口迅速激增，2013年我國肥胖人口數(shù)量已居世界首位[4]。值得注意的是，我國育齡年齡段即20至39歲的人群中，肥胖率高達(dá)11.1%[5]。由此可見，我國的肥胖問題相當(dāng)嚴(yán)峻，亟需引起高度重視。

很多研究顯示，肥胖與2型糖尿病和胰島素抵抗密切相關(guān)，其與心腦血管疾病的發(fā)生也有很大的關(guān)系[7]。另外，肥胖也被證實(shí)與癌癥以及一系列骨骼肌疾病的發(fā)生有關(guān)[8]。目前，除了先天遺傳因素造成的肥胖以外，學(xué)者們更為關(guān)注的是環(huán)境因素引起的肥胖，尤其是飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣導(dǎo)致的肥胖。長期進(jìn)食高卡路里食物如高脂飲食是當(dāng)前肥胖癥發(fā)病的一個很大誘因。肥胖作為一種由代謝紊亂引起的疾病，往往伴隨著線粒體的功能障礙[9]。線粒體的動力學(xué)受到代謝需求的調(diào)控。代謝信號變化時，線粒體會做出相應(yīng)的動態(tài)變化，如融合和裂變，以適應(yīng)代謝的需求。細(xì)胞代謝水平的改變會影響線粒體的數(shù)量、組成和功能。高脂飲食引起的肥胖會破壞線粒體的呼吸作用，造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，繼而導(dǎo)致活性氧水平增加[10]、線粒體膜電位降低[11]。研究表明高脂飲食誘導(dǎo)會引發(fā)超質(zhì)量大鼠線粒體生物合成和融合過程的減少以及裂變的增加[12]。通過檢測線粒體超微結(jié)構(gòu)[13]、膜電位[14]、mtDNA 拷貝數(shù)[15]，可以準(zhǔn)確分析線粒體的結(jié)構(gòu)、功能和數(shù)量，綜合評估線粒體功能。

近年來，肥胖對男性生殖功能的影響越來越引起研究者們的關(guān)注。臨床研究表明，超質(zhì)量和肥胖的男性與BMI正常的男性相比，精子的質(zhì)量明顯下降，表現(xiàn)為精子濃度下降、精子活動力降低、頂體反應(yīng)異常、精子形態(tài)異常、精子DNA損傷增加[16]等。有研究統(tǒng)計(jì)了1973年至2011年，北美、歐洲、澳大利亞和新西蘭等國家的男性精液質(zhì)量表明：近四十年來，男性精液質(zhì)量明顯下降，而營養(yǎng)攝入和飲食習(xí)慣的改變是影響其精液質(zhì)量的重要因素[17]。這也促使我們關(guān)注由飲食因素引起的肥胖對雄性生殖的影響。線粒體被認(rèn)為是評估精子質(zhì)量最重要的細(xì)胞器。大量的研究已經(jīng)表明，肥胖能夠明顯損傷男性生殖功能，其中最為顯著的就是精子活動力的損傷，然而肥胖引起的雄性精子活動力低下是否與線粒體異常有關(guān)尚未可知。

因此，本研究擬通過高脂飲食誘導(dǎo)構(gòu)建雄性肥胖小鼠模型以模擬由飲食引發(fā)的肥胖癥；隨后觀察小鼠睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu)，檢測小鼠雄性生育力各項(xiàng)指標(biāo)，并進(jìn)一步檢測小鼠精子線粒體功能及數(shù)量以探究肥胖導(dǎo)致小鼠精子質(zhì)量下降的機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

3周齡的C57BL/6雄性小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司；45%fatKcal%（MD12032）高脂飼料和10%fatKcal%（MD12031）對照組飼料購自江蘇美迪森公司。

二、主要試劑與儀器

（一）試劑

Tyrode's Salt Solution（Sigma-Aldrich），羅丹明 123染液（DOJINDO），JC-1染液（上海翊圣生物科技有限公司），Percoll試劑（上海翊圣生物科技有限公司），血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒 （北京天根生化科技有限公司），SYBR Premix Ex Taq（2×）（TaKaRa）。

（二）主要儀器

計(jì)算機(jī)輔助精液分析儀（Hamilton Thorne），流式細(xì)胞檢測儀 CytoFLEX LX（Beckman），ND-1000 紫外分光光度計(jì)（NanoDrop），熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems 7500），數(shù)碼顯微鏡（Nicon E600）。

三、方法

（一）構(gòu)建肥胖實(shí)驗(yàn)動物模型

購入3周齡的C57BL/6雄鼠后將其安置于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。在適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分成正常飲食（control diet,CD）組和高脂飲食（high-fat diet,HFD）組，并給予相應(yīng)飲食喂養(yǎng)。使用苦味酸對小鼠進(jìn)行標(biāo)記，每周稱量小鼠體質(zhì)量并記錄直至第14周。所有小鼠均處于12 h光照12 h黑暗且能夠自由飲水的SPF級實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境中。

（二）小鼠肝臟及睪丸形態(tài)學(xué)觀察

采用過量的3.5%水合氯醛麻醉處死已建模成功的小鼠，取其肝臟及睪丸置于Bouin氏液中浸泡并固定過夜，梯度乙醇脫水處理后用石蠟包埋組織，二甲苯脫蠟后再用梯度乙醇復(fù)水處理，室溫下晾干后進(jìn)行HE染色處理，最后用中性樹膠封片，置于數(shù)碼顯微鏡下觀察并拍照。

（三）小鼠生育力參數(shù)檢測

相同方法處死小鼠后取出其附睪尾部組織，置于37°C預(yù)熱的Tyrode's緩沖液中，用眼科手術(shù)剪稍剪2～3 刀， 隨后在 37°C 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 15 min，使精子能夠充分游出。取上清至1.5 mL Ep管中，充分混勻后取10 μL滴至預(yù)熱的Marker板 （精子標(biāo)本檢測容器）凹槽中，將檢測板置于CASA儀上隨機(jī)選擇若干視野，保證所看到的精子數(shù)大于400個，分析并記錄精子運(yùn)動力百分?jǐn)?shù)、前向運(yùn)動力及濃度等指標(biāo)。

（四）JC-1染色檢測小鼠精子線粒體膜電位

按照說明書配制JC-1染液，經(jīng)CASA儀確定精子的濃度，精子終濃度選定為2×108個/400μl，隨后按照精子培養(yǎng)液與染液1:1的比例對精子進(jìn)行染色，置于37°C 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，按照說明書配制洗滌液，500×g 離心 5 min，重復(fù)此步驟 3 次，400 μL 洗滌液重懸后經(jīng)流式細(xì)胞儀對樣品進(jìn)行檢測。每管樣品的終體積為 400 μL。

（五）羅丹明123染色檢測小鼠精子線粒體膜電位

取上述已經(jīng)檢測了濃度的精子樣本，按照染液終濃度為20μM，體系終體積為400μL，精子終濃度為2×108個/400μL的比例，向精子樣本中加入羅丹明123染液，置于37°C 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，隨后500×g離心5 min，用PBS清洗樣本兩次，400μL PBS重懸樣本后經(jīng)流式細(xì)胞儀對樣品進(jìn)行檢測。

（六）流式細(xì)胞儀檢測小鼠精子線粒體膜電位

使用流式細(xì)胞儀檢測樣品，CytExpert軟件分析收集的樣品信息，樣品的吸取速度為30 μl/min，F(xiàn)ITC通道收集由羅丹明-123染色的精子熒光信號，激發(fā)波長為507 nm，發(fā)射波長為529 nm。FICT和PE通道分別同時收集由JC-1染色的精子熒光信號，其中綠色激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為530 nm，紅光激發(fā)波長為525 nm，發(fā)射波長為590 nm。共收集10000個精子。

（七）檢測小鼠精子mtDNA拷貝數(shù)

根據(jù)說明書提取小鼠精子DNA，經(jīng)q-PCR儀檢測mtDNA的拷貝數(shù)，反應(yīng)程序設(shè)置為：第一步，預(yù)變性：95°C 15 s； 第二步，PCR 反應(yīng)： 95°C 15 s,60°C 60 s，40個循環(huán)；獲得溶解曲線。隨后，根據(jù)Ct值計(jì)算相應(yīng)的目的基因表達(dá)量，2-△△Ct法確定兩組小鼠基因的相對表達(dá)水平。引物序列來源于之前已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)[18]。MTCYTB引物：上游引物5'-ACCAATCTCCCAAACCATCA-3'，下游引物 5'-TCCAGAGACTTGGGGA TCTAAC-3'；MTCO1引物：上游引物 5'-CTCGCCTAATTTATTCCACTTCA-3'，下游引物5'-GGGGCTAGGGGTAGGGTTAT-3'；MTCO2引物：上游引物5'-ACCTGGTGAACTACGACTGCTAGA-3'，下游引物5'-TGCTTGATTTAGTCGGCCTGGGAT-3'；MTND1引物：上游引物5'-GGGATAACAGCGCAATCCTA-3'，下游引物 5'-ATCGTTGAACAAACGAACCA-3'；MTATP6引物：上游引物5'-CAGTCCCCTCCCTAGGACTT-3'，下游引物 5'-TCAGAGCATTGGCCATAGAA-3'；β-actin引物：上游引物 5'-GGGAAT GGGTCAGAAGGACT-3'，下游引物5'-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3'。

（八）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，GraphPad Prism 6軟件繪制柱狀圖，所有的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行計(jì)算，雙尾假設(shè)置信區(qū)間為0.95，P＜0.05。

結(jié) 果

一、兩組小鼠體質(zhì)量比較及肝臟形態(tài)學(xué)分析

高脂飲食喂養(yǎng)小鼠4周，即鼠齡為7周時，兩組小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)明顯差異，隨著喂養(yǎng)時間的延長，兩組小鼠的體質(zhì)量差異愈發(fā)顯著，鼠齡為14周時，兩組小鼠體質(zhì)量分別為 HFD 組（32.25±0.37）g 和 CD 組（27.30±0.29）g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。觀察兩組小鼠肝臟的HE染色切片發(fā)現(xiàn)，與CD組小鼠相比，HFD組小鼠的肝臟細(xì)胞空泡化現(xiàn)象明顯，呈現(xiàn)出嚴(yán)重的脂肪肝現(xiàn)象，見圖1。

圖1 CD組和HFD組小鼠在喂養(yǎng)相應(yīng)飲食10周后體質(zhì)量變化及肝臟形態(tài)學(xué)分析

二、兩組小鼠生育力參數(shù)比較及睪丸形態(tài)學(xué)分析

經(jīng)CASA儀檢測小鼠精子生育力的各項(xiàng)參數(shù)后發(fā)現(xiàn)，與 CD 組（63.10±8.08）%相比，HFD 組小鼠（44.80±3.82）%精子活動力百分?jǐn)?shù)明顯降低（P＜0.01），HFD組小鼠精子前向運(yùn)動精子百分率 （20.10±4.01）%也明顯低于CD組小鼠（25.10±4.42）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 這表明肥胖小鼠精子的活動力和前向運(yùn)動力都明顯下降，而二者的精子濃度卻沒有顯著差異，其中CD組 (26.81±4.87106/mL)，HFD 組(28.09±7.49106/mL)，見圖 2。

睪丸的形態(tài)學(xué)分析結(jié)果顯示，與CD組相比，HFD組小鼠的睪丸形態(tài)明顯異常，其睪丸生精上皮組織明顯萎縮，生精細(xì)胞排列松散，支持細(xì)胞和生精細(xì)胞之間黏附減弱，出現(xiàn)大量間隙。由此可見，肥胖小鼠睪丸的生精功能受到了損傷，見圖2。

圖2 CD組和HFD組小鼠生育力參數(shù)及睪丸形態(tài)學(xué)分析。

三、JC-1染色顯示肥胖組小鼠精子線粒體膜電位顯著降低

使用JC-1對兩組小鼠精子線粒體進(jìn)行染色，發(fā)出紅色熒光表明線粒體的膜電位處于較高的狀態(tài)，而綠色熒光則表明線粒體膜電位較低。結(jié)果顯示，小鼠的精子染色后紅光與綠光的平均熒光強(qiáng)度比值HFD組 （8.88±0.62）明顯低于 CD 組（11.61±0.58）小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。該結(jié)果說明HFD組小鼠精子線粒體膜電位降低，表明其精子線粒體功能受損明顯，見圖3。

四、羅丹明123染色發(fā)現(xiàn)肥胖組小鼠精子線粒體膜電位顯著降低

使用羅丹明123染液對小鼠的精子線粒體進(jìn)行染色，隨后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析各自的熒光強(qiáng)度。在線粒體膜電位較低時，羅丹明123會從線粒體釋放到胞漿中而發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，因此熒光強(qiáng)度與膜電位成反比。與CD組相比，HFD組小鼠精子線粒體染色后的陽性區(qū)域向右偏移，這表明其熒光強(qiáng)度明顯增高。與CD組（253129.99±53714.50）相比，HFD 組（330619.58±47965.79）小鼠精子線粒體的平均熒光強(qiáng)度顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示其精子線粒體膜電位降低，線粒體功能受損。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與運(yùn)用JC-1染色的結(jié)果高度一致，也進(jìn)一步說明肥胖可導(dǎo)致小鼠精子線粒體功能受損，影響小鼠的精子活動力，見圖4。

圖3 使用JC-1染液分別對HFD組和CD組小鼠精子線粒體染色結(jié)果

圖4 羅丹明-123對CD組和HFD組小鼠精子染色結(jié)果

五、HFD組小鼠精子mtDNA拷貝數(shù)無明顯變化

為了探究兩組小鼠精子線粒體數(shù)量是否存在差異，我們對兩組小鼠精子mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明HFD組小鼠精子線粒體數(shù)量正常，見圖5。

圖5 CD組和HFD組小鼠精子mtDNA拷貝數(shù)

討 論

當(dāng)前，肥胖已經(jīng)成為影響全球人類健康的重要危險(xiǎn)因素之一，其危害不容忽視。本研究通過構(gòu)建肥胖雄鼠模型以模擬由于飲食改變而引起的肥胖癥，從而進(jìn)一步探究肥胖影響雄性生育功能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食喂養(yǎng)10周后，伴隨著體質(zhì)量的增加，HFD組小鼠的肝臟組織切片呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞空泡化現(xiàn)象。兩組小鼠的生育力參數(shù)分析的結(jié)果顯示，HFD組小鼠的精子活動力、前向運(yùn)動精子百分?jǐn)?shù)明顯降低，這與我們之前的研究一致[19]。同時睪丸形態(tài)學(xué)分析顯示，肥胖小鼠睪丸生精上皮中，生精細(xì)胞排列松散，生精細(xì)胞與支持細(xì)胞的黏附減弱，表明生精過程受到干擾。需要指出的是，我們的實(shí)驗(yàn)中，雖然肥胖小鼠精子的活動力和前向運(yùn)動精子百分?jǐn)?shù)明顯降低，但兩組小鼠的精子濃度卻沒有顯著差異。我們推測主要原因是，雖然生精上皮結(jié)構(gòu)紊亂，但還是具有各級生精細(xì)胞，可以產(chǎn)生精子。為了進(jìn)一步探究肥胖損傷雄性精子活動力的機(jī)制是否與精子尾部中段的線粒體異常有關(guān)，我們隨后分析了精子的線粒體數(shù)量和功能是否發(fā)生了改變。

線粒體是由外膜和內(nèi)膜組成的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，鑲嵌在內(nèi)膜上的氧化呼吸鏈（Electron transport chain,ETC）是ATP產(chǎn)生的重要基礎(chǔ)，且維持著線粒體內(nèi)部較高的負(fù)極線粒體膜電位 （Mitochondrial membrane potential,Δψ）。膜電位的維持對于線粒體功能至關(guān)重要，膜電位降低會對呼吸鏈上各因子的氧化還原狀態(tài)，膜間隙的離子和代謝物的分布規(guī)律產(chǎn)生負(fù)面影響，從而影響線粒體正常的生理功能。因此，線粒體膜電位的大小被認(rèn)為是線粒體“健康”指標(biāo)[20]。而線粒體膜電位可以作為一個更為靈敏的數(shù)據(jù)來評估精子的質(zhì)量[21]。通過檢測線粒體膜電位來推斷線粒體功能可作為男性生育力檢查的一個重要指標(biāo)。有研究表明，精子線粒體膜電位的降低會導(dǎo)致精子活動力和受精能力的下降[22]。另一方面，mtDNA的拷貝數(shù)異常也會影響雄性的生殖功能[23]。Gyun等[24]比較了正常男性和弱精男性的精子mtDNA拷貝數(shù)后發(fā)現(xiàn)，精液異常的患者與正常男性相比，其精子mtDNA拷貝數(shù)增加，但是mtDNA的完整性顯著降低。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，睪丸的mtDNA拷貝數(shù)降低會導(dǎo)致精母細(xì)胞和精子畸變，而增加mtDNA拷貝數(shù)能夠在一定程度上恢復(fù)睪丸的部分功能[25]。

本研究同時對兩組小鼠精子線粒體的膜電位和mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)行了檢測分析。利用兩種染液對精子線粒體進(jìn)行染色，隨后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析精子染色后的平均熒光強(qiáng)度以表示精子線粒體膜電位的大小。熒光探針法是研究線粒體膜電位最常用的方法之一。當(dāng)前廣泛使用的探針分為兩類：一類是熒光強(qiáng)度探針，較常使用的是羅丹明123、四甲基羅丹明甲酯等[26]。該類型探針在線粒體膜電位正常的情況下會在線粒體內(nèi)引起強(qiáng)烈的聚集而發(fā)生熒光淬滅（aggregation-caused quenching,ACQ），發(fā)出微弱的熒光。當(dāng)線粒體膜電位降低時，一部分探針進(jìn)入細(xì)胞，這時線粒體內(nèi)的探針濃度較低而發(fā)出更強(qiáng)的熒光，但該類探針的局限性在于無法準(zhǔn)確地判斷膜電位是消失還是降低。另一類探針是雙色熒光探針，常用的是JC-1探針[27]，這類探針在線粒體膜電位高時呈現(xiàn)聚集的狀態(tài)而發(fā)出紅色的熒光，在膜電位低時以單體的形式存在而發(fā)出綠色的熒光。通過熒光的顏色變化可判斷膜電位的變化趨勢，通常用紅色和綠色平均熒光強(qiáng)度的比值來表示載有JC-1的細(xì)胞線粒體的膜電位[28]。因此，JC-1是研究線粒體膜電位使用最廣泛的熒光指示劑。目前，已有很多研究運(yùn)用探針檢測精子線粒體膜電位[29]。與熒光探針染色相匹配的測定方法是流式細(xì)胞術(shù)，它能夠用于評估精子活動力、頂體完整性、獲能狀態(tài)、DNA狀態(tài)、線粒體功能等。與傳統(tǒng)地使用顯微鏡觀察精子相比，流式細(xì)胞術(shù)最大的一個特點(diǎn)就是能夠在短時間內(nèi)對大量的精子進(jìn)行分析。這也使得流式細(xì)胞術(shù)能夠非常靈敏地發(fā)現(xiàn)各種精子之間的細(xì)微差別，同時也是流式細(xì)胞術(shù)與其他檢測儀器相比的最大優(yōu)點(diǎn)。通過對精子進(jìn)行染色且經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測可以很好地觀察精子的形態(tài)及其各組分的功能。因此，流式細(xì)胞術(shù)被廣泛用于測定精子線粒體的膜電位[30]。

在本項(xiàng)研究中，我們同時運(yùn)用JC-1和羅丹明123對正常和肥胖小鼠的精子進(jìn)行染色以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。使用JC-1對兩組小鼠精子進(jìn)行染色，隨后分別比較了正常組和肥胖組小鼠精子染色后發(fā)出的紅光與綠光平均熒光強(qiáng)度的比值。結(jié)果顯示，肥胖組相比于正常組，其比值明顯降低，這表明在肥胖組小鼠精子中JC-1多以單體的形式存在，線粒體的膜電位明顯降低而線粒體功能受損。同時，羅丹明123對正常和肥胖小鼠精子染色的結(jié)果顯示，肥胖組平均熒光強(qiáng)度明顯高于正常組，由于熒光強(qiáng)度與膜電位成反比，這表明肥胖組小鼠的精子線粒體膜電位與正常組相比明顯降低，該結(jié)果與我們使用JC-1染色的結(jié)果高度一致。與此同時，我們對兩組小鼠精子的mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示兩者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明這兩組小鼠精子線粒體數(shù)量并沒有差異，而線粒體的功能卻明顯受損。

我們的研究結(jié)果證明，肥胖的確能夠引起精子活動力和前向運(yùn)動精子百分?jǐn)?shù)的減弱，盡管肥胖個體的睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，但還是能夠產(chǎn)生精子；肥胖小鼠精子線粒體數(shù)量無明顯的變化，但膜電位卻明顯下降，這提示其精子線粒體功能紊亂。因此，本研究進(jìn)一步證實(shí)了肥胖小鼠精子線粒體膜電位下降可能是其活動力和前向運(yùn)動精子百分?jǐn)?shù)減弱的重要原因之一。