高效液相色譜－飛行時(shí)間－串聯(lián)質(zhì)譜和隨機(jī)森林算法的蜜炙百合與生百合指紋圖譜研究

蔡 萍，何 丹，陳 林，梁雪娟，唐純玉，張水寒，黃惠勇

（1．湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南長(zhǎng)沙410013；2．湖南省中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；3．湖南時(shí)代陽光藥業(yè)股份有限公司，湖南永州425000；4．湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410208）

2015版《中國(guó)藥典》收載的藥用百合為百合科植物卷丹（LiliumlancifoliumThunb．）、百合（Lilium browniiF．E．Brown var．viridulumBaker）或細(xì)葉百合（LiliumpumilumDC．）的干燥肉質(zhì)鱗葉［1］。百合最早收錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是藥食兩用之品。生百合及蜜百合為臨床常用飲片，煉蜜有“補(bǔ)脾氣，潤(rùn)肺燥”之功，故蜜炙后百合潤(rùn)肺止咳的作用增強(qiáng)，多用于肺虛久咳、肺癆咳血等癥，是輔料與藥物的協(xié)同作用所致。

高效液相（HPLC）指紋圖譜強(qiáng)調(diào)對(duì)樣品組成的系統(tǒng)表征及穩(wěn)定性組分的鑒定及評(píng)估，被廣泛用于中藥質(zhì)量控制研究［2－3］。但單一的指紋圖譜無法明確樣品間差異來源，在精確篩選質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分方面存在缺陷。化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，如相似性分析（SA）、主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和偏最小二乘法－判別分析（PLS－DA）等已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織（WHO）［4］及其他部門［5］引入，并接受用于復(fù)雜多分量系統(tǒng)的定性分析和質(zhì)量控制［6－9］。本研究收集23批不同來源的生百合及蜜炙品，建立百合蜜炙前后的HPLC指紋圖譜；利用中藥相似性分析軟件，找到兩類百合的共有峰；應(yīng)用隨機(jī)森林算法對(duì)指紋進(jìn)行分類識(shí)別，為百合的質(zhì)量控制和指標(biāo)成分的選擇提供依據(jù)，為全面控制百合質(zhì)量提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器及試劑

Agilent1200高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；布氏漏斗。

乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；H3PO4（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）；純凈水（華潤(rùn)怡寶飲料有限公司）。

1．2 實(shí)驗(yàn)樣本

本研究通過購買和到主產(chǎn)區(qū)采集方式，獲得了23份蜜炙百合與生百合樣本，并經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究所劉浩助理研究員鑒定為百合科植物卷丹（Lilium lancifoliumThunb．）的干燥肉質(zhì)鱗葉，樣品包括13批蜜炙百合：S1（豪州市貢藥飲片廠）、S2（安徽大別山）、S3（湖南衡陽）、S4（湖南龍山石牌鎮(zhèn)）、S5（湖南龍山冼洛鄉(xiāng)）、S6（安徽毫藥千草國(guó)藥股份有限公司）、S7（湖南隆回縣北山鄉(xiāng)）、S8（亳州華云飲片有限公司）、S9（河北祁新中藥顆粒飲片有限公司）、S10（保定商宇藥業(yè)有限公司）、S11（湖南龍山縣茅坪鄉(xiāng)干壩村）、S12（保定商宇藥業(yè)有限公司）、S13（湖南白羊鄉(xiāng)）；以及10批生品百合：S14（豪州市貢藥飲片廠）、S15（湖南衡陽）、S16（湖南邵東縣界嶺）、S17（湖南龍山石牌鎮(zhèn)）、S18（云南灣塘鄉(xiāng)）、S19（湖南龍山冼洛鄉(xiāng)）、S20（亳州華云飲片有限公司）、S21（湖南龍山縣石牌鎮(zhèn)紅橋村）、S22（湖南龍山縣三元鄉(xiāng)青崗村）、S23（湖南省龍山縣桶車鄉(xiāng)）。

1．3 實(shí)驗(yàn)條件

1．3．1 供試品溶液的制備 取百合樣品粉末（過40目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩）約4．0g，精密稱定，加入80%甲醇溶液50mL，靜置20min，超聲30min，過濾，濾液經(jīng)0．22μm微孔濾膜濾過，制得供試品溶液。

1．3．2 色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18柱（250×4．6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0．3%H3PO4溶液（B），梯度洗脫：0～5min，5%～8%A；5～7min，8%A；7～18min，8%～16%A；18～20min，16%A；20～25min，16%～18%A；25～28min，18%～20%A；28～38min，20%A；38～43min，20%～24%A；43～50min，24%A。流速：1．0mL／min；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：20μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm。

1．3．3 質(zhì)譜條件 電噴霧電離（ESI）；檢測(cè)方式：負(fù)離子模式；干燥氣溫度325℃；干燥氣體積流量11．0 L／min；鞘氣溫度350℃；毛細(xì)管電壓4．0V。負(fù)離子模式獲得電噴霧電離質(zhì)譜圖，全掃描質(zhì)譜范圍m／z100～1 000。

1．4 方法學(xué)考察

1．4．1 精密度實(shí)驗(yàn) 取湖南龍山冼洛鄉(xiāng)蜜百合供試品溶液（樣品5），按優(yōu)化色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜。以6號(hào)峰為參照峰計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的精密度，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值均小于3，符合指紋圖譜技術(shù)要求，表明儀器等整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)精密度高。

1．4．2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 平行制備6份供試品溶液，按“1．3．2”色譜條件進(jìn)行分析。計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積考察方法重復(fù)性，其RSD均小于3%，說明方法重現(xiàn)性良好。

1．4．3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液（樣品5），按優(yōu)化色譜條件，分別在0、6、12、24、48h檢測(cè)指紋圖譜。計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD值均小于3%，表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1．5 統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)（2004藥典版）》軟件分析百合HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)，確定共有峰，生成對(duì)照?qǐng)D譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。以共有峰面積為變量，將各批次樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab軟件，采用隨機(jī)森林算法來分析研究不同來源蜜炙百合和生百合的差異，篩選導(dǎo)致樣品間差異的化學(xué)成分。

2 結(jié)果與討論

2．1 提取條件選擇

考察了80%乙醇、50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇等不同提取溶劑對(duì)提取效率的影響。結(jié)果顯示，以80%甲醇作為提取溶劑獲得的成分最豐富，含量相對(duì)較高。

2．2 色譜條件優(yōu)化

使用二極管陣列檢測(cè)器在200～400nm波長(zhǎng)范圍對(duì)樣品進(jìn)行掃描，分析比較各波長(zhǎng)下色譜圖。結(jié)果顯示，250nm下檢測(cè)到各成分相對(duì)較好，分離度良好，峰數(shù)目最多，基線平穩(wěn)，特征峰明顯且峰形較好，能最大程度的反映樣品信息。其次對(duì)水相（0．3%甲酸水溶液和0．3%H3PO4水溶液）進(jìn)行考察，結(jié)果表明流動(dòng)相pH值對(duì)百合酚酸糖苷類類化合物色譜峰的分離有一定影響，0．3%H3PO4水溶液作為水相可獲得更好的分離效果。

2．3 百合HPLC指紋圖譜

將23批生百合和蜜百合按優(yōu)化色譜條件分別進(jìn)樣，得到各樣品的HPLC色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)（2004藥典版）》軟件分析，選擇分離度好且出峰數(shù)多的18號(hào)樣品作為參照譜圖，時(shí)間寬度0．5，中位數(shù)為相關(guān)系數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行自動(dòng)匹配，得到生百合和蜜百合不同來源指紋圖譜分析，見圖1。

圖1 23批百合的HPLC指紋圖譜Fig．1 HPLC fingerprint of 23batches of Lilium

2．4 共有峰確認(rèn)

23批蜜百合和生百合共提取到13個(gè)共有峰，生成對(duì)照指紋圖譜（圖2）。按照優(yōu)化質(zhì)譜條件，采用負(fù)離子模式分析，對(duì)13個(gè)共有峰進(jìn)行分析鑒定，根據(jù)其質(zhì)譜信息和裂解規(guī)律，參考文獻(xiàn)報(bào)道共解析得到6個(gè)酚酸糖苷類成分，分別為王百合苷C（3號(hào)峰）、王百合苷A（5號(hào)峰）王百合苷D（6號(hào)峰）、王百合苷F（7號(hào)峰）王百合苷B（10號(hào)峰）和4－乙酰王百合苷D（11號(hào)峰）。質(zhì)譜結(jié)果見圖3。

圖2 百合對(duì)照指紋圖譜及共有峰Fig．2 Lilium control fingerprint and common peaks3．Regaloside C；5．Regaloside A；6．Regaloside D；7．Regaloside F；10．Regaloside B，11．4－Acetyl derivative of regalosid e D．

化合物3，tR＝16．278min，m／z：415．1273［M－H］－，二級(jí) 掃 描 裂 解 產(chǎn) 生 m／z：253［M－H－C6H10O5］－，179［M－H－C9H16O7］－，161［M－H－C9H16O7－H2O］－，135［M－H－C9H16O7－CO2］－（圖3），分子式為 C18H24O11，相對(duì)分子質(zhì)量為415．1273，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［10］鑒別化合物3為王百合苷C。

化合物5和化合物6的相對(duì)保留時(shí)間分別為：21．153min與24．198min，它們具有相同m／z：399［M－H］－，二級(jí)掃描裂解產(chǎn)生相同裂解碎片 m／z：237［M－H－C6H10O5］－、163［M－H－C9H16O7］－、145［M－H－C9H16O7－H2O］－、119［M－H－C9H16O7－CO2］－（圖3），分子式為 C18H24O10，相對(duì)分子質(zhì)量分別為：399．1317與399．1316，結(jié)合出峰先后及文獻(xiàn)報(bào)道［11］，鑒別化合物5和化合物6分別為王百合苷A、王百合苷D。

化合物7，tR＝26．280min，m／z：429．1424［M－H］－，二級(jí)掃描裂解產(chǎn)生 m／z：429［M－H］－、267［M－H－C6H10O5］－、193［M－H－C9H16O7］－、175［M－H－C9H16O7－H2O］－、149［M－H－C9H16O7－CO2］－（圖3），分子式為C19H26O11，相對(duì)分子質(zhì)量為429．1424，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［12］，鑒別化合物7為王百合苷F。

化合物10和化合物11的相對(duì)保留時(shí)間分別為：36．929min與37．614min，它們具有相同的m／z：441［M－H］－，二 級(jí) 掃 描 裂 解 產(chǎn) 生 m／z：381［M－H－C2H2O－H2O］－、163［M－H－C11H18O8］－、145［M－H－C11H18O8－H2O］－、119［M－H－C11H18O8－CO2］－（圖3），分子式為C20H26O11，結(jié)合出峰先后及文獻(xiàn)報(bào)道［13］，鑒別化合物10和化合物11分別為王百合苷B、4－乙酰王百合苷D。

2．5 無監(jiān)督模式識(shí)別的分析結(jié)果

圖3 負(fù)離子模式下百合中5個(gè)成分的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig．3 Mass spectra of 5species in Lilium in negative ion mode

利用23批樣品中的13個(gè)共有峰及其峰面積，構(gòu)建出23×13的數(shù)據(jù)矩陣，將得到的數(shù)據(jù)矩陣輸入隨機(jī)森林算法進(jìn)行分類識(shí)別，用于判別生品和蜜炙百合間的差異。在構(gòu)建分類識(shí)別模型的過程中，可得到樣品間的相似性矩陣，并進(jìn)一步利用多維特征尺度變換（MSD），將其映射到特征空間從中找到樣品間的相互關(guān)系（相似或相近程度）（圖4）。可見生品和蜜炙百合間存在較大的差異，并且在構(gòu)建分類模型的過程中，可得到各共有峰對(duì)分類的貢獻(xiàn)度，以貢獻(xiàn)度的高低來判別各共有峰的重要性，見圖5。從圖5中可見，峰6（王百合苷D）和峰10（王百合苷B）具有最高的貢獻(xiàn)度，為百合品類的鑒別提供了更加確切的依據(jù)。

圖4 生百合與蜜百合分類圖Fig．4 Classification map of candied Lilium and raw Lilium

圖5 各變量的分類重要度Fig．5 Classification importance of each variable

3 結(jié)論

本文利用高效液相色譜－飛行時(shí)間－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和模式識(shí)別方法，對(duì)不同來源的生百合與蜜百合樣本進(jìn)行分析，能有效區(qū)分生品與蜜炙的樣品。本研究是對(duì)現(xiàn)有方法的有效補(bǔ)充，隨機(jī)森林算法更加適合多類數(shù)據(jù)的分類分析，能為百合的質(zhì)量評(píng)估提供新的方法和依據(jù)。