檢測牛奶和水中卡那霉素殘留物的電化學適配體傳感器研究進展

李鳳琴，俞志剛＊，韓賢達，石文兵

（1．長江師范學院化學化工學院無機特種功能材料重慶市重點實驗室博士后科研工作站，重慶涪陵408100；2．哈爾濱理工大學化學與環境工程學院，黑龍江哈爾濱150040）

1 概述

卡那霉素是一種氨基糖苷類抗生素，它廣泛應用于治療革蘭陽性和革蘭陰性菌引起的嚴重感染，在畜牧業中常作為獸藥來使用［1］。與其他抗生素類獸藥一樣，卡那霉素的普遍應用造成了不同基質，尤其是牛奶和水中存在一定的殘留［2－4］。經常飲用和食用含有卡那霉素的飲品和食品，會導致其累積從而對人體產生嚴重的毒副作用，如失聰、傷腎、藥物過敏和耐藥性等［5－9］。因此，開發快速而準確的卡那霉素殘留檢測技術，實現其有效監控，對確保食品和環境安全進而保障人們健康具有重要意義。

近年來，適配體及其篩選技術因顯示出特異性高、親和力強、結合靶標范圍寬、易于合成和穩定性好等優點得到了蓬勃發展，在生化分析等領域的應用受到了廣泛關注，基于適配體的生物傳感技術成為當前農獸藥殘留新型檢測技術的前沿研究熱點之一［10－12］。作為一類重要的適配體生物傳感技術，電化學適配體傳感器具有器件組裝成本低、操作簡單、免樣品前處理、可便攜式和易于實現現場監測等特點，是未來發展的重要方向之一［13－14］。

本文對近5年采用電化學適配體傳感器方法檢測牛奶和水中卡那霉素殘留的相關研究進行綜述，揭示當前該技術的研究現狀、優勢、局限性和所存在的問題，并對未來的發展趨勢進行展望。

2 電化學適配體傳感技術

2．1 適配體簡介

適配體（Aptamer）一詞最初源于拉丁語“Aptus”，原指為一種可與靶標物質高度契合的聚合物［15］。適配體在本質上是指通過人工合成的可高特異性和高親和力結合靶標物質的一段單鏈寡聚核苷酸（DNA和RNA）或肽的片段，其與靶標物質的作用類似于抗原－抗體之間的作用［16］。作為已經被證明是一類傳感器應用中重要而有效地分子識別物質，與其他分子識別物質相比，適配體顯示出5個方面的突出優點［17］：（1）高的特異性與親和力；（2）可結合靶標物質范圍寬；（3）易于通過化學合成和體外篩選獲得；（4）分子量小；（5）穩定性和可重復性好。以上優點使適配體在構建電化學傳感器的應用上成為理想的生物接收器［18－20］。

2．2 傳感器分類與結構

電化學技術被廣泛地用于食品和水中污染物的檢測［21－25］。因該技術檢測成本低、操作簡單快速、抗污染能力強、易微型化和實現在線監測，具有極好的應用化和商業化前景，與其他技術相比，顯示出明顯的優勢。根據輸出參數，如阻抗、電流和電位，電化學適配體傳感器一般可對應分為三種類型，即阻抗型傳感器、電流型（安培／伏安）傳感器和電位（電勢）型傳感器。電化學檢測技術與適配體篩選技術相結合，極大地促進了適配體傳感器的發展，為解決復雜基質樣品中各類污染物分析提供了可行解決方案［26－30］。

電化學適配體傳感器主要由敏感分子識別元件和轉換器兩部分組成。轉換器部件一般又分為修飾層、電極基底和電學系統三部分。用作修飾層的物質，如有機分子、導電聚合物和納米材料等起著適配體和基底的連接作用，可有效改善電子傳遞效率實現電信號的擴增。用作基底的一般是由不同材料做成的電極，如Au電極、玻碳電極（GCE）、銦錫氧化物電極（ITO）和固體聚合物電極（SPE）等。電學系統通常包括一個信號擴增器、處理器和顯示設備，其中檢測技術最為重要。敏感分子識別元件又稱為生物接收器，其依靠適配體與目標物進行作用，作用大小由轉換器測量并輸出為可測電信號，該信號與目標物濃度成比例關系，進而顯示出目標物在樣品中的存在水平，實現定量檢測［31－32］。

2．3 電化學檢測技術

2．3．1 差分脈沖伏安法（DPV） DPV法被認為是線性掃描伏安法和階梯掃描伏安法的衍生方法。具體做法是在電勢線性掃描和階梯掃描上施加一系列常規脈沖電壓，且在電勢改變之前完成電流測定。在DPV法中由于所測電流為電解電流和電容電流之和，且采用電流差值方式對電勢作圖，可有效減小背景電流中電容電流和雜質氧化還原電流的干擾，因而利于獲得高的靈敏度和低的檢出限，同時易于在一次掃描中對具有不同氧化還原電勢的多種物質實現同時檢測，在傳感器構建中常被用作定量檢測技術，獲得了廣泛應用。盡管該方法具有明顯優點，但在復雜基質中，由幾種電活性物質產生的對電流響應的電勢干擾仍難以消除［33］。

2．3．2 方波伏安法（SWV） SWV法的本質是一種極譜分析方法。實驗方法是在通常的、緩慢改變的直流電壓上疊加一個低頻率和小振幅的方形波電壓，在方波電壓方向變化前一瞬間記錄通過電解池的交流電流。因該方法在充電電流消失時刻開始記錄電流，可有效消除充電電流的干擾，獲得高的檢測靈敏度。與DPV法一樣，SWV法也是傳感器構建中最常用的定量檢測技術之一［34－35］。

2．3．3 交流伏安法（ACV） ACV法是一種疊加交流電的伏安法。實驗方法是在工作電極上施加一個隨時間慢掃描的直流電勢Edc，并疊加峰－峰值為5mV的正弦波交流成分Eac。測量電流的交流成分的幅值和相對于Eac的相角，得到相應的交流伏安圖。圖中存在明確的電流峰，其大小與溶液中電活性物質的濃度成正比。由于該方法有效消除了充電電流的干擾，濃度測量精度可達10－7mol／L數量級，適合于定量檢測，同時也常用于測量電極反應的動力學參數和研究反應機理［36］。

2．3．4 電化學阻抗譜法（EIS） EIS法是電化學暫態技術的一種。常用的是正弦波交流阻抗技術。實驗方法是通過控制電極電流（或電極電勢）使其按正弦波規律隨時間小幅度變化，同時測量作為其響應的電極電勢（或電流）隨時間的變化規律。在具體應用中，該方法是通過探測溶液體系中電極／電解液界面性質的特征變化感知電極表面生物分子復合物的形成［37］。通常情況下，該技術比其他電化學暫態技術更易給出電極界面和電極過程動力學的各種參數，同時可以用來對即時發生的兩或多個電化學反應進行識別并對如通過鈍化膜擴散發生的擴散限制反應進行鑒定。它還可以用來對使用自身電極的組裝器件成分進行檢測并提供相關的電極轉移反應速率信息。近年來，隨著阻抗適配體傳感器的發展，這一信號輸出技術顯示出許多顯著的優點，如受基質干擾效應小、檢測范圍寬、穩定性高和易于實現自動化［38］。

3 卡那霉素電化學適配體傳感器研究進展

近5年來，隨著適配體篩選技術的發展和卡那霉素適配體的報道，采用核酸適配體為分子識別元件的電化學卡那霉素適配體傳感器的研究引起了人們廣泛關注，具體參數總結對比列于表1，分別為采用DPV、SWV、ACV和EIS四種電化學測量技術對牛奶和水中的卡那霉素殘留進行了檢測。獲得的檢測限介于1．3fmol／L～8．6nmol／L之間，普遍低于我國農業部235號公告［57］《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》中規定的抗生素最大殘留限定范圍1～100ng／g（約為1～100nmol／L），以及歐盟法規標準《歐盟食品中獸藥殘留限量標準》（EC470／2009）［58］，傳感響應時間多數介于30～120min之間。

表1 牛奶和水中卡那霉素檢測電化學適配體傳感器參數對比一覽表Table 1 Data sheet of parameter comparison of reported electrochemical aptasensors for the detection of kanamycin in milk or water

3．1 電流型適配體傳感器

3．1．1 基于DPV技術 基于DPV檢測技術，研究人員設計了多種精妙方案以大幅度降低對目標物卡那霉素的檢測限，進而提高傳感器靈敏度，其中最為有效的當屬多重循環信號擴增策略的應用。Feng等［48］將雜交鏈式反應（HCR）和立足點介導鏈取代反應（TMSTR）結合，實現了對目標物雙重信號擴增檢測，其檢測限值低至16fmol／L。該方法先將S1／S2雜交探針和S3分別自組裝在Au電極E－1和E－2表面，其中S1和S2雜交形成S1／S2雙鏈結構。S2中間為適配體堿基序列，兩邊為立足點序列T1和T2。T1和T2可驅動目標物循環和雜交鏈式反應。加入卡那霉素后，其與S2反應生成復合物并游離于溶液體系，然后在T1介導下復合物中的S2與S3發生雜交同時將卡那霉素釋放進行下一循環，從而實現一級信號擴增。生成的S2／S3雙鏈上暴露的T2可驅動雜交鏈式反應形成長雙鏈結構因可結合更多的亞甲基藍（MB）指示劑而實現二級信號擴增。雙級信號擴增的實現是該傳感器高靈敏度的主要原因。

Wang等［45］將目標物引發多重循環信號擴增的方法引入到傳感器的構建中。其方法是：在目標物第一分子卡那霉素的存在下，莖環型探針HP1打開誘發酶輔助目標物循環擴增反應的發生，同時自發引起第二分子卡那霉素的生成。第二分子卡那霉素不僅可以跟HP1雜交且可取代電極上的Helper探針，結果導致標記MB的HP2探針形成封閉型結構，將MB拉近電極表面，電子傳遞效率大幅度提高，獲得了檢測限低至1．3fmol／L的超高靈敏度。

近年來，納米材料如碳納米管（CNTs）、石墨烯（GR）、導電聚合物（CPs）和金屬納米粒子（MNPs）等，以及其復合材料因具有比表面積高、生物兼容性好、導電效率高和獨特的物理化學特性等優點，在改善電極表面電子傳遞效率方面表現優異，越來越多地被應用于適配體傳感器的制備中［59－64］。Guo［43］以MWCNTs、1－丁基－3－甲基六氟磷酸鹽咪唑鎓離子液體和納米孔PtTi（NP－PtTi）合金復合材料修飾GCE，構建了基于適配體的卡那霉素傳感器。以DPV法為定量信號測量技術，在優化條件下，對卡那霉素檢測的線性范圍為0．05～100ng／mL，獲得的檢測限為3．7pg／mL。Xu等［41］則采用了石墨烯－聚苯胺（GR－PANI）和聚酰胺－胺型樹枝狀高分子功能化的AuNPs（PAMAM－Au）復合材料，同時借助HRP對H2O2的酶催化反應，獲得了對卡那霉素4．6pg／mL的檢測限。該傳感器在構建上先分別用GR－PANI和PAMAM－Au滴涂在GCE表面，再依靠靜電吸附作用將卡那霉素抗體固定，最后用牛血清白蛋白（BSA）和10個堿基的A序列即Poly（A）10混合溶液封閉電極。在信號機制上采用了夾心型結構形成結合酶催化的信號轉換方式：在卡那霉素存在時，抗體與卡那霉素結合，HRP標記的鏈霉親和素和修飾適配體的生物素結合，并通過適配體與卡那霉素作用以三明治結構耦合在電極表面，在H2O2體系中借助HRP的催化作用產生高的催化電流；相反，在無卡那霉素的情況下，耦合作用無法發生，催化電流低。作為高效的電流信號擴增反應方式，酶催化引入傳感信號機制利于獲得高的靈敏度，但同時也存在對實現條件要求苛刻而產生的檢測不穩定缺陷，不利于在實際復雜樣品體系中的應用。

3．1．2 基于SWV技術 基于SWV檢測技術，Xu等［52］在傳感器構建中引入核酸外切酶，并借助其循環剪切作用實現了對卡那霉素低至1pmol／L檢測限的超靈敏檢測。該傳感器信號機制為：加入卡那霉素之前，適配體互補DNA（cDNA）的巰基化5′端通過Au－S鍵嫁接于電極表面，并與適配體以完全互補雜交雙鏈存在。加入核酸外切酶，因其剪切作用引發cDNA的自消化并釋放適配體，被釋放的適配體開始第二輪剪切過程，并循環進行至電極表面所有cDNA自消化完畢。此時殘余cDNA很短，釕離子吸附量少，電子傳遞效率低，獲得背景電流小；加入卡那霉素后，因其與適配體結合形成適配體／卡那霉素復合物從而抑制了適配體與cDNA的雜交，核酸外切酶不起作用，電極表面cDNA長度不變，釕離子吸附量變大，電子傳遞效率增高，檢測電流增強。該傳感體系因借助核酸外切酶的循環剪切作用實現了背景信號的大幅度壓縮，利于相對增大響應信號變化絕對值而獲得較高的傳感靈敏度。Chen等［53］建立了同時檢測卡那霉素和四環素的分析方法。該傳感器在構建上先將分別負載Cd2＋和Pb2＋的金屬有機框架材料（MOFs）分別與卡那霉素適配體和四環素適配體結合，形成兩目標物的示蹤信號探針（分開的出峰電流示蹤各自的電流信號），然后利用anti－ssDNA抗體與適配體DNA之間的特異性作用將兩示蹤信號探針混合嫁接于免疫磁珠表面從而構筑成混合型適配體傳感器；在信號機制上借助RecJf核酸外切酶催化目標物的循環擴增方法：在加入卡那霉素和四環素之前，因磁珠表面布滿示蹤信號探針背景電流信號高；加入兩目標物后，因適配體與各自目標物反應導致示蹤信號探針與磁珠分離，同時RecJf核酸外切酶將適配體剪切釋放目標物實現第一次循環，釋放出的目標物可激發下一循環的發生，循環往復以實現對磁珠表面示蹤信號探針的無限次循環剪切，從而獲得超低的檢測電流。利用該方法傳感器對兩種目標物獲得了較低的檢測限，對卡那霉素為0．15pmol／L，對四環素為0．18pmol／L。同時，該課題組在該工作基礎上又借助核酸內、外切酶作用實現了雙循環信號的擴增，并用于卡那霉素和氯霉素的同時檢測，獲得了較高的靈敏度，對兩目標物的檢測限分別為35fmol／L和21fmol／L［54］。

3．1．3 基于ACV技術 基于ACV檢測技術，本課題組［55］建立了基于信號探針轉移機制的傳感器用于牛奶、水和血清中卡那霉素殘留物檢測。如圖1所示，在信號機制上采用了目標物誘導信號探針轉移的方式：加入卡那霉素之前，捕獲探針與輔助探針以雙鏈的“單撐式”結構存在，因信號探針游離于溶液體系中，標記指示劑亞甲基藍（MB）遠離電極表面，電子傳遞效率低，背景電流小；而加入卡那霉素后，卡那霉素被捕獲探針捕獲，取代輔助探針與捕獲探針反應形成捕獲探針／卡那霉素莖結狀復合物，釋放后的輔助探針與游離于溶液中的信號探針雜交成雙鏈結構將MB拉近至電極表面，電子傳遞效率增大，檢測電流升高。該體系因信號探針的游離而獲得了超低的背景信號，利于獲得高的靈敏度，對卡那霉素的檢測限低至3．3 pmol／L，同時獲得了較快的傳感速度。

3．2 阻抗型適配體傳感器

圖1 基于目標物誘導信號探針轉移機制的適配體傳感器工作示意圖［55］Fig．1 Working schematic diagram of aptamer sensor based on target－induced signaling probe shifting mechanism［55］

基于EIS檢測技術，Sharma研究組［56］構建了一次性便攜式的阻抗適配體傳感器用于牛奶中卡那霉素的檢測。在信號機制上采用了阻抗增強的方式：加入目標物之前，電子傳遞效率高，阻抗小；加入目標物后，適配體特異性捕獲目標物形成復合物覆蓋在電極表面，阻礙了電子傳遞通道，阻抗增大。阻抗變化與目標物濃度相關。在優化條件下，該傳感器對目標物檢測獲得了1．2～75ng／mL的線性范圍和0．11ng／mL的檢測限。以鏈霉素（Streptomycin）和慶大霉素（gentamicin）為參照干擾物，顯示出對卡那霉素較好的選擇性，同時以牛奶為實際樣品對該方法進行加標回收率考察，獲得回收率為96．88%～100．5%（RSD＝4．56%，n＝3）的較好結果。

4 結語

對已有適配體卡那霉素研究成果綜述分析表明，隨著適配體篩選技術和電化學、光學等多種檢測技術，以及各種納米及其復合材料的發展與聯合，精妙的傳感設計不斷涌現，基于卡那霉素適配體的傳感器獲得了較好的發展，但仍然停留在理論和實驗室研究階段，距離實際應用化的路還很長，關鍵問題仍有待解決和完善，主要體現在如下三方面：（1）提高靈敏度：文獻所報道傳感器的檢測限盡管大部分都很低，可滿足實際樣品檢測限的要求，但都是在純緩沖溶液體系中得到，受基質干擾影響，在實際復雜樣品中會有明顯降低。這些傳感器的靈敏度仍有待提高；大部分文獻之所以獲得了較高靈敏度，均借助了酶促反應實現信號擴增或采用納米材料進行電極修飾以提高電子傳遞效率，由于操作條件苛刻和不穩定，在實際復雜基質樣品中不易獲得良好的表現，難以應用化。因此，開發無酶無納米材料修飾的高靈敏度傳感器是實現應用化的客觀要求；（2）改善特異性：傳感器對靶分子的特異性在很大程度上由所用適配體對靶分子的特異性所決定。受篩選時的實驗誤差和所構建傳感器的傳感環境與適配體篩選時實際化學環境的差異以及報道結果的主觀因素等多方面影響，傳感器的特異性表現往往并不完美。通過優化所構建傳感器的結構進一步改良特異性是期待解決的問題；（3）提高傳感速度：已報道的傳感器響應速度慢，普遍介于30～120min，考慮到實際應用時其他必要步驟的消耗，完整檢測過程耗時長，不利于建立現場快速監測方法，有待改進。

有理由相信，通過科研工作者的不懈努力，制約傳感器發展的瓶頸問題必定會逐步解決，設計和構建具有實際商業化價值的快速、準確和便攜式電化學適配體傳感器設備實現獸藥殘留的在線監測是一個具有廣闊應用前景的目標，值得研究和期待。