痕量氨基酸分析方法研究進展

何繼杰，張曉鳳＊，錢莉莉，封 麗，趙天濤

（1．重慶理工大學化學化工學院，重慶400050；2．重慶市環境科學技術研究院，重慶400045）

1 前言

氨基酸（Amino Acids，AAs）在環境、食品、生物、醫學等領域中都扮演著重要的角色，例如：水源中痕量AAs是形成含氮消毒副產物的重要前體物，其類型和濃度水平對含氮消毒副產物的控制顯得尤為重要［1］；食品中痕量AAs常以游離態、多肽和蛋白質等形態存在，是反映食品營養及品質的一個重要指標，也可反映食品是否受污染、添加合成AAs［2－5］；人體尿液或血液中痕量AAs類型與濃度可反映人體各項生理指標［2］。因此，對痕量AAs的快速、準確分析在環境學、營養學、代謝組學和生物學的研究中都十分重要，受到國內外大量研究者的高度重視。

自然界中已發現的AAs有300多種，其中組成生物體蛋白質的約有20種。由于AAs種類繁多，樣品基體復雜，且大多不具有紫外或熒光信號，往往無法定量，常需借助衍生化技術將其衍生后再進行測定。目前AAs的分析檢測方法主要有：基于通用型儀器的氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）和毛細管電泳法（CE），以及基于已商品化的氨基酸分析儀法。牟世芬等［6］和邢健等［7］對AAs的分析方法進行了綜述，他們比較了不同方法的優缺點，但沒有對AAs的類型、數量、檢出限，衍生化試劑的性質與適用范圍等方面進行綜述?；诖?，本文對痕量AAs分析的不同方法的關鍵影響因素進行系統綜述。

2 氣相色譜法（GC）

采用GC法測定痕量AAs時，需先將AAs衍生為易氣化的組分，然后進行分離檢測，其關鍵在于選擇合適的衍生化試劑和使用方法的檢測限。該方法已用于食品（酸乳酒［8］）、醫學（皮膚［9］、尿液［10－11］）、生物（玉米種子［12］、煙草［13］）和環境（發酵液［14］）等領域中痕量 AAs的分析，用到的色譜柱有毛細管柱［9－14］和環糊精手性柱［8］。目前，GC法使用的衍生化試劑主要有氯甲酸乙酯（Ethyl Chloroformate，ECF）、三氟乙酰丙酮（Trifluoro Acetylacetone，FAA）、五氟丙酸酐（Pentafluoro Propionic Anhydride，PFPA）、三氟乙酸酐（Trifluoroacetic Anhydride，TFAA）、N－叔丁基二甲基甲硅烷基－N－甲基三氟乙酰胺（N－Tert－butyl Dimethyl Silyl－N－methyl Trifluoroacetamide，MTBSTFA）和 N－甲基－N－（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N－methyl－N－（Trimethylsilyl）trifluoroacetamide，MTTFA）。其中，ECF 只能實現對少數 AAs的衍生化［9－12］。為了更有效地衍生多種AAs，Khuhawar等［9］采用ECF＋FAA衍生化體系，實現了皮膚樣本中19種AAs的有效衍生化，但衍生化操作較為繁瑣。GC法采用火焰離子化檢測器的檢測限為100～1 000 μg／L［8－9］。而GC與質譜聯用其檢測限可達到幾十至幾百ng／L，如對尿液［10］中AAs的檢測限可以達到44．8～6 244ng／L。

衍生化產物的穩定性是痕量AAs分析準確性與重現性的關鍵所在，衍生化試劑的選擇性，衍生化條件、衍生化速率、衍生化試劑的價格與危害性是操作能否順利實施需要重點考慮的指標。文獻報道的衍生化方法的具體情況見表1。衍生化試劑FAA、PFPA和TFAA是基于與極性AAs的R基團反應而形成的衍生化產物，MTBSTFA可與含有氨基、羧基、羥基的AAs反應，MSTFA可與含有羥基、羧酸、硫醇和胺類的AAs反應，ECF與AAs反應的機理文獻中未見報道。由此可見不同衍生化試劑對AAs衍生化的選擇性不同。目前GC法沒有一種衍生化試劑能實現20種基本AAs的有效衍生化，其分析測試條件有待進一步探索與優化，才能逐步應用于20種基本AAs及其它各類AAs的分析測定。

表1 GC法衍生化試劑Table 1 Some derivatization reagents for analysis of AAs by GC

3 高效液相色譜法（HPLC）

3．1 HPLC柱前衍生法

HPLC柱前衍生法涉及的衍生化試劑主要有7種，根據衍生化后檢測信號不同可分為熒光型衍生化試劑，如鄰苯二甲醛（o－Phthalaldehyde，OPA）、丹酰氯（Dansyl Chloride，Dansyl－Cl））；紫外型衍生化試劑如，4－氯－3，5－二硝基三氟甲苯（4－Chloro－3，5－dinitrobenzotrifluoride，CNBF）、異硫氰酸苯酯（Phenyl Isothiocyanate，PITC）、6－氨基喹啉基－N－羥基－琥珀酰亞胺基甲酸酯（6－Aminoquinolinyl－N－hydroxy－succinimide formate，AQC）、Dansyl－Cl和9－氯甲酸芴甲酯（9－Methyl chloroformate，FMOC－Cl）、2，4－二硝基氟苯（2，4－Dinitrofluorobenzene，DNFB））。HPLC柱前衍生法分析的痕量 AAs涉及到食品（枸杞［15］、麥冬［16］、樹莓［17］、稻米［18］、荔枝［19］和普洱茶［20］等）、醫學（血漿［21］、血清［22］、體液［23］和唾液［24］等）和生物（小鼠腦組織［25］、胚胎干細胞［26］、魚卵［27］）等領域。HPLC柱前衍生法涉及的色譜柱有 C18柱［15－17，20，．22－25］、生化分析柱［21，27］和氨基酸分析柱［19］。在現有的報道中，采用紫外檢測器（UVD）和熒光檢測器（FLD）的檢測限均可達幾百ng／L的水平［15－28］。檢測器的選用取決于所采用的衍生化試劑。同GC法一樣，衍生化產物穩定性，選擇性、操作難易程度和衍生化速率，以及衍生化試劑的價格與危害性等是我們關注的重點。已報道方法的具體情況見表2。

衍生化過程除FMOC－Cl［28］只與AAs上的R基的醇羥基和酚羥基反應外，其余的都能與氨基反應，其中 AQC［26］和Dansyl－Cl［24］還能和R基上的胺反應，而且Dansyl－Cl還能與 AAs的酚羥基反應，故這些衍生化試劑對AAs衍生化選擇性也各有差異。綜上，除了FMOC－Cl衍生化試劑外，其它衍生化試劑都能實驗20種基本AAs的衍生化，但AAs衍生化產物的穩定性、檢測器對其靈敏度有待進一步考證。現有報道中，以PITC或OPA為衍生化試劑，在C18柱上，通過UVD或FLD均可以實現20種痕量基本AAs的分析檢測，可為我們在建立痕量AAs的分析檢測方法提供參考。

3．2 HPLC柱后衍生法

相較于柱前衍生法，柱后衍生需采用特定色譜柱和附設加溫裝置，價格昂貴，對儀器設備要求較高。衍生化試劑只涉及茚三酮（Ninhydrin，NIN）和OPA兩種，具體見表3。HPLC柱后衍生法的樣品也涉及了食品（竹筍［29］、黃酒［30］和產貝母［31］）和生物（花粉［32］、百合［33］、煙草［34］）等領域；涉及的色譜柱有：LCA K07／Li柱［30－33］、陽離子樹脂填充柱［29］、陽離子交換柱［31－32，34］，其中陽離子交換柱使用較多；陽離子樹脂填充柱在120min內實現了竹筍中20種基本AAs的分析測定［35］，LCA K07／Li柱在110min內實現了黃酒中20種基本AAs的分析測定，耗時幾乎是GC法和HPLC柱前衍生化法的2倍；檢測器以UV和FLD為主，其檢測限達μg／L水平，不及HPLC柱前衍生化法。

表2 HPLC柱前衍生法衍生化試劑Table 2 Some precolumn derivatization reagents for analysis of AAs by HPLC

表3 HPLC柱后衍生法衍生化試劑Table 3 Some post－column derivatization reagents for analysis of AAs by HPLC

衍生化過程中，衍生化試劑都是與AAs的氨基反應［33－34］，兩種衍生化試劑的選擇性相近，但OPA成本更高。根據現有文獻，以NIN為衍生化試劑，在陽離子樹脂填充柱或LCA K07／Li柱上，利用FLD可實現20種痕量基本AAs的分離檢測分析。

4 毛細管電泳法（CE）

為了實現對痕量AAs的CE分離檢測，合適的分離體系是其關鍵。痕量AAs采用CE法涉及的分析樣品、緩沖液、分離電壓、衍生化試劑、分析時間、方法的檢測限等都是需要關注的幾個方面。同時由于AAs缺乏生色團，CE法也需要對AAs先進行衍生化處理，再進行分離測定。滿足激光誘導熒光檢測器（Laser Induced Fluorescence Detector，LIFD）檢測分析涉及到幾種新的衍生化試劑：4－氯－7－硝基苯并－2－氧雜－1，3－二唑（4－Chloro－7－nitrobenzo－2－oxa－1，3－diazole，NBD－Cl）、4－氟－7－硝基苯并－2－氧雜－1，3－二唑（4－Fluoro－7－nitrobenzo－2－oxa－1，3－diazole，NBD－F）和異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）。CE法涉及到的檢測器有：LIFD、UVD、安培檢測器（Amperometric Detector，AD）和電容耦合非接觸電導檢測（Capacitive Coupling non－contact conductivity detection，C4D）。

CE法分析檢測痕量 AAs涉及食品（蜂蜜［35］）、醫學（藥地龍［36］、淮山［37］、太子參［38］和保健飲品［39］）和生物（大腦［40］、尿液／海馬組織［41］）等領域；緩沖體系以硼酸鹽為主［39－41］，分離電壓在－24～22kV 之間［35－43］，這些分離條件是易實現的。但是該方法涉及的AAs種類相對較少，且缺乏對20種基本AAs分離分析的報道。分析時間都在20min內，相對HPLC法和GC法明顯縮短［35－43］；由于AD具有高靈敏度，非常適用于痕量AAs的檢測，但只局限于具有電化學活性的組分。CE法涉及衍生化試劑相關信息見表4。

CE法分離效果較好，分析速度相對較快，其難以替代的優點在于極低的樣品需求量，但CE法重現性較差是限制其廣泛應用最大的問題。目前采用CE法進行痕量AAs的檢測分析方面的研究較少，有許多待完善和探索的空間。

表4 CE法衍生化試劑Table 4 Some derivatization reagents for analysis of AAs by CE

綜上所述，傳統痕量AAs衍生化檢測分析方法研究相對較多，但操作比較繁瑣，影響因素和可能存在的干擾較多，能否適于各類未知樣本中20種基本痕量AAs的分析還有待探索，在分析速度和準確性方面還有待提高。如能夠實現AAs的直接分離檢測，避免衍生化過程受衍生化試劑的選擇性、中間產物的干擾、衍生化產物不穩定等多種因素的影響，是實現痕量AAs快速、準確分析的理想途徑。

5 直接測定法

傳統GC、HPLC和CE法分析測定痕量AAs時，要么受分離技術的限制，如GC只適用于易氣化組分，要么受分析檢測器的限制，如UV和FLD只適用于對紫外和熒光有響應的組分，AD只適用于具有電活性的組分；痕量AAs檢測分析都需要衍生化預處理，而衍生化操作復雜，現有的衍生化試劑適用性范圍過窄，當用于未知樣品中痕量AAs的快速準確分析時，影響因素過多，重現性往往難以得到保證。目前，痕量AAs的直接檢測法主要涉及：利用HPLC法適用范圍廣的優勢與廣譜性檢測器不受限的特點，HPLC－MS、HPLC－蒸發光散射檢測法（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）聯用法是比較理想的痕量AAs檢測分析方法。HPLC－積分脈沖安培檢測技術（Integrated Pulsed Amperometric Detection，IPAD）、高效陰離子交換色譜－積分脈沖安培檢測技術（HPAEC－IPAD）也是對電活性組分有響應的痕量AAs檢測分析方法。除此之外，還有CE－MS和微流控芯片技術等等。具體見表5。

表5 直接檢測法檢測痕量AAsTable 5 Direct detection of trace AAs

相對于現行的其他設備，直接檢測法極大提高工作效率，減少了因檢測周期長而造成檢測時樣本內個別AAs相互轉化的影響，尤其是生物樣本，如李鵬飛等［53］采用同位素內標標記LC－MS／MS技術檢測AAs，在15min內檢測人體內30種AAs。這些新型分析手段的出現將大大促進痕量AAs檢測分析技術的發展。

6 氨基酸分析儀法

除了上述基于通用型儀器的GC、HPLC、CE等方法，目前，市場上存在基于商品化的氨基酸分析儀法。該方法是基于HPLC柱后衍生法而發展起來的方法，但無需將待測AAs進行柱前或柱后衍生，且自動化程度比通用型儀器法更高。近來，關于采用AAs分析儀分析檢測各領域中的痕量AAs，結果如表6所示。

表6 氨基酸分析儀檢測痕量氨基酸Table 6 Amino acid analyzer for the detection of trace amino acids

AAs分析儀法測定痕量AAs的檢測限與基于通用型儀器的方法沒有顯著性差異，這主要是因為它也是根據HPLC柱后衍生法的原理而建立的方法，但其檢測的AAs類型相對其他方法的優勢較為明顯，其能夠實現除了20種基本AAs外的AAs的定性和定量，如You Shin等［60］采用AAs分析儀驗證16種結構AAs，對嬰兒配方奶粉AAs的準確檢測起到重要作用，保證了奶粉的合格性。另外，王棘等分別采用HPLC法和AAs分析儀法對腸外營養注射液進行測定，結果發現，相對于HPLC法，AAs分析儀法具有操作簡便、分析快速等優點，且線性范圍更廣，更適合腸外營養注射液中AAs的測定。

將AAs分析儀方法與基于通用型儀器法對比，重點關注適用AAs種類、分析時間、是否衍生化、操作難易、檢測限和重現性等指標，結果如表7所示。

表7 AAs檢測方法對比Table 7 Comparison of different detection methods for AAs analysis

7 展望

基于通用型儀器法的AAs分析檢測技術需要對其進行衍生化處理，操作過程繁瑣，影響因素較多：色譜柱類型、衍生化試劑及其適用范圍、衍生化操作難易程度、衍生化產物的穩定性、衍生化試劑成本、檢測器、檢出限等，因此確保方法的重現性是其實現痕量AAs分析檢測的關鍵。綜合考慮，痕量AAs的測定時，HPLC柱前衍生法為優先選擇考慮的方法；而氨基酸分析儀法顯示了其專一性，很好的避免了上述問題，更能夠保證數據分析的準確性，但是其本身儀器價格非常昂貴，這也限制了其廣泛使用。本文已總結出多種衍生化試劑適用于20種基本AAs及其它各類AAs的定性定量分析，研究者需根據具體情況，選擇適當分析測試條件，實現痕量AAs準確快速分析測定。直接分析測定技術避免了繁瑣的衍生化步驟，適用于20種基本AAs的快速分析檢測，大大簡化前處理操作，其中ELSD是HPLC法的一種新型通用性檢測器，特別適用于無UV和FLD信號的AAs和糖類組分的測定，但對痕量AAs的分析檢測有待結合高效前處理技術（如固相萃取、固相微萃取等），進一步提高該方法的檢出限。HPLC－MS的目前痕量AAs分析檢測最為理想的選擇，但還是受設備成本高的限制。