固相萃取－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定地表水中10種磺胺類抗生素殘留

龐昕瑞，曾鴻鵠，2，3，梁延鵬＊，2，3，覃禮堂，2，3，莫凌云，2，3

（1．桂林理工大學環(huán)境科學與工程學院，廣西桂林541004；2．廣西環(huán)境污染控制理論與技術重點實驗室，廣西桂林541004；3．巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西桂林541004）

隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，我國獸藥抗生素的使用量在日益增加［1］。由于磺胺類藥物（Sulfanilamide，SAs）是最早人工合成的抗生素之一，其具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉等優(yōu)點，被廣泛用于人工養(yǎng)殖和臨床治療，成為使用量最大的抗生素之一［2］。但是，SAs難以被動物吸收代謝且遷移性強、難降解［3］，因此約60%～90%的原藥［4］和代謝產(chǎn)物隨糞便和尿液排出動物體外后，通過淋溶、滲透等方式進入自然環(huán)境中，對地表水、土壤和地下水造成污染［5－6］。因此，對我國自然環(huán)境中磺胺類藥物的污染水平進行分析研究是十分必要的。

自然環(huán)境中抗生素的濃度大多處于ng／L～μg／L水平，且環(huán)境基質(zhì)復雜多樣，因此需要根據(jù)實際的環(huán)境條件對前處理和分析方法進行優(yōu)化選擇。環(huán)境樣品中SAs抗生素的檢測通常是先經(jīng)過固相萃取（SPE）富集凈化，再結(jié)合高效液相色譜－紫外／熒光檢測器（HPLC－UVD／FLD）［7］、高效液相色譜－質(zhì)譜（HPLC－MS）［8］、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC－MS／MS）［9］、超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS／MS）［10］等方法進行檢測。由于超高效液相色譜在靈敏度、分離度、分析效率上較高效液相色譜有很大的提高，可大大縮短分析用時、降低實驗溶劑用量。因此，本研究采用SPE－UPLC／MS／MS建立了同時檢測地表水水樣中10種SAs抗生素殘留的分析方法。該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、實用性強，可快速地完成對目標物的分析，為水體中SAs藥物的定性定量分析檢測提供技術保障，并已成功應用于濕地地表水中10種SAs抗生素殘留的檢測。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

WatersXevo TQ－S Micro超高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜儀（美國，Waters公司）；AQUA Trace ASPE 799型固相萃取儀（日本，島津公司）；雙頻超聲波清洗器；24位氮吹儀；Vortex Genie 2渦旋振蕩器。

10種磺胺類藥物標準品：磺胺嘧啶（SD）、磺胺吡啶（SPY）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、甲氧芐啶（TMP）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺甲惡唑（SMZ）、磺胺地索辛（SDM）、磺胺喹噁啉（SQ），純度≥97%，均購自 Dr．Ehrenstorfer GmbH 公司（德國）；甲醇（色譜純，＞99．9%，德國 Merck公司）；甲酸（色譜純，≥98．0%，阿拉丁）；乙酸乙酯（色譜純，＞99．0%，阿拉丁）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，水為Milli－Q型超純水儀（美國，Millipore公司）制備的超純水。

1．2 混合標準儲備溶液與工作溶液的配制

精確稱量各標準品10mg，分別置于100mL棕色容量瓶中，加入甲醇超聲溶解后定容，配成質(zhì)量濃度為0．1g／L的單標準儲備溶液，于－20℃下儲存。取上述儲備溶液用甲醇稀釋為500μg／L的混合標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1．3 樣品前處理

1．3．1 水樣采集和預處理 采集1L桂林會仙濕地部分地表水水樣于棕色玻璃瓶中，用稀H2SO4先將水樣pH調(diào)至4．0～6．0，于4℃保存。水樣運回實驗室后立即經(jīng)0．45μm玻璃纖維濾膜過濾，用稀H2SO4和氨水調(diào)節(jié)水樣pH＝6．0，并在3d內(nèi)完成對所有水樣的固相萃取。

1．3．2 樣品的固相萃取 依次用5mL的乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V），5mL 氨水－甲醇（3∶100，V／V）溶液，5mL超純水活化Oasis HLB固相萃取柱（6mL／500mg，美國 Waters公司），取500mL水樣以3mL／min流速過柱，用6mL超純水淋洗萃取柱，在氮氣下干燥20min，再依次用5．5mL乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V），5．5mL氨水－甲醇（3∶100，V／V）溶液進行洗脫，最后將收集的洗脫液在氮氣下緩慢地吹至近干，加入1mL含30%甲醇溶液超聲溶解殘留物，漩渦混合約1min，過0．22μm濾膜后，置于棕色進樣瓶中，待上機測定。

1．4 測定方法

1．4．1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（100×2．1mm，1．7μm）；流動相為含0．1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫條件：0～1min，10%～12%B；1～7min，12%～50%B；7～10min，50%～70%B；10～10．1min，70%～10%B；10．1～12min，10%B。柱溫為40℃；進樣量為2μL；流速為0．3mL／min。

1．4．2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離（ESI）；正離子掃描（ESI＋）模式；毛細管電壓：2．94kV；脫溶劑溫度：600℃；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣流速：1 000L／h；監(jiān)測方式為多時段－多反應（MRM）監(jiān)測。10種目標物的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 目標抗生素的MRM MS參數(shù)Table 1 Parameters of MRM MS for target antibiotics

2 結(jié)果與討論

2．1 質(zhì)譜－色譜條件的優(yōu)化

首先對儀器進行自動調(diào)諧，參考調(diào)諧文件對質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。實驗發(fā)現(xiàn)沒有錐孔氣流速時，目標物的峰形不發(fā)生分叉且響應值高。為提高離子掃描時目標物的靈敏度，本研究考察了不同比例甲酸水溶液作流動相對目標物靈敏度的影響。結(jié)果表明在含0．1%甲酸水溶液條件下各物質(zhì)的峰形、響應值和分離度達到最佳狀態(tài)。此外，有研究表明，色譜柱的長短會影響目標物的分離效果和保留時間［11］。本實驗研究了色譜柱柱長對目標物的色譜行為的影響，結(jié)果顯示當色譜柱柱長為50mm時，目標物無法達到理想的分離效果和出峰情況；當色譜柱柱長為100mm時，10種目標物的峰形無拖尾：TMP和SM2可完全分離、SMP和SCP質(zhì)譜檢測可分離、SQ和SDM的峰形更加尖銳且無分叉，如圖1所示。因此實驗選用柱長為100mm的色譜柱進行色譜分離。

圖1 10種磺胺類抗生素的總離子流（TIC）色譜圖（色譜柱長100mm）Fig．1 TIC chromatogram of 10sulfonamide antibiotics with column length of 100mm1．SD；2．SPY；3．SMR；4．TMP；5．SM2；6．SMP；7．SCP；8．SMZ；9．SDM；10．SQ．

2．2 固相萃取條件的優(yōu)化

2．2．1 洗脫溶劑、洗脫體積、萃取柱的選擇 乙酸乙酯常用做萃取劑、提取劑，且極性小于甲醇。實驗結(jié)果顯示單獨用甲醇進行洗脫回收率低于乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V）。有研究［12］表明，在甲醇中加入氨水可以改變目標物在固相萃取柱上的存在形態(tài)，降低固相萃取柱對目標物的相互作用力，增大回收率，因此本實驗優(yōu)化了萃取體系中氨水比例，發(fā)現(xiàn)在體系中加入3%的氨水更容易將目標物洗脫下來（圖2）。為確保洗脫完全，進行兩次洗脫，結(jié)果表明第二次洗脫目標物殘留均小于0．05μg／L。最終確定依次用5．5mL乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V），5．5mL 氨水－甲醇（3∶100，V／V）淋洗固相萃取柱。此外，本研究分別考察了C18固相萃取柱（6mL／500mg，德國CNW 公司）、Oasis HLB固相萃取柱（6mL／500mg，美國 Waters公司）對目標物的富集效果。結(jié)果顯示，HLB柱的回收率明顯優(yōu)于C18柱。

2．2．2 水樣pH值和水樣上樣流速的選擇 水樣的pH很大程度地影響了目標物在水樣中的存在形態(tài)、穩(wěn)定性以及固相萃取柱對目標物的富集效果，因此用稀H2SO4和氨水將水樣（超純水）pH值分別調(diào)節(jié)為2．0～7．0進行回收率對比實驗。由圖3可知，當pH＜6．0時，SCP、SMZ、SDM和SQ的回收率均未達到80%；而當pH＝6．0時，各目標物的回收率均有明顯提高，上述4種物質(zhì)的回收率提升至85．15%～89．79%；pH＞6．0時，各目標物的回收率較在pH＝6．0的條件下略有下降，因此本研究選擇將水樣調(diào)至pH＝6．0。

圖2 洗脫液中氨水比例對10種抗生素回收率的影響Fig．2 Effect of ammonia ratio in eluents on recoveries of the ten antibiotics

圖3 水樣pH對10種抗生素回收率的影響Fig．3 Effect of pH on the recoveries of the ten antibiotics in water samples

考察了不同上樣流速（3、5、10mL／min）對目標物回收率的影響。研究表明，當上樣流速為10mL／min時，僅TMP的回收率為88%，其他物質(zhì)的回收率為69．8%～75．63%；當上樣流速為5mL／min時，對SD的富集效果仍不理想，回收率為73．62%；當上樣流速為3mL／min時，除SCP的回收率為74．61%外，其余9種目標物的回收率保持在80．85%～89．01%。此外，當上樣流速從3mL／min升至10mL／min時，對SD和SPY回收率的損失達11%。因此最佳上樣流速選為3mL／min。

2．3 基質(zhì)效應

用質(zhì)譜定量分析環(huán)境樣品時，基體效應（離子抑制或者離子增強）會影響目標物定量結(jié)果的準確度，因此在實驗時需要考慮基質(zhì)效應的影響。按照文獻報道［13］研究基質(zhì)效應的方法進行實驗。結(jié)果表明，10種目標物的基質(zhì)效應在81．17%～103．76%之間。當基質(zhì)效應在80%～120%范圍內(nèi)，可忽略基質(zhì)效應［13］。

2．4 方法的線性范圍及儀器的檢出限和定量限

配制10種目標物的混合標準溶液系列（1～500μg／L），按上述色譜－質(zhì)譜條件進行分析，采用外標法和離子比（定量離子／定性離子）定量，結(jié)合目標物出峰的保留時間、母離子和子離子（定性離子和定量離子）進行定性。分別用3倍和10倍信噪比對應的標樣濃度來估算儀器的檢出限、定量限。結(jié)果表明10種目標物在1～500μg／L范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)r2＞0．999，結(jié)果見表2。

表2 10種抗生素的保留時間、線性方程、相關系數(shù)（r2）、檢出限和定量限Table 2 Retention time，linear equation，correlation coefficient（r2），limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the ten antibiotics

2．5 加標回收率及方法檢出限

準確量取500mL桂林會仙濕地地表水，分別以低（10ng／L）、中（50ng／L）、高（100ng／L）3個濃度水平對水樣進行加標，做6個平行樣，同時作空白對照。按1．3及1．4節(jié)所述方法對水樣進行處理和分析。由表3可知，10種目標物的低、中、高濃度加標回收率分別為81．90%～93．69%、77．94%～96．83%、84．14%～104．98%，相對標準偏差（RSD）＜8．1%，方法檢出限在0．12～0．84ng／L范圍內(nèi)，且水樣進行低濃度加標實驗時各物質(zhì)的峰形尖銳完整，基線平穩(wěn)（圖4）。說明該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢出限低、結(jié)果準確可靠。

表3 10種抗生素的水樣加標回收實驗、相對標準偏差和方法檢出限（LODs）（n＝6）Table 3 Spiked recoveries，relative standard deviations（RSDs），and limits of detection（LODs）for ten antibiotics in water samples（n＝6）

圖4 水樣加標質(zhì)量濃度為10ng／L時目標物的MRM色譜圖Fig．4 MRM chromatograms of the target analytes in water samples spiked at 10ng／L

2．6 實際樣品測定

按照本文所建立的方法對4個桂林會仙濕地地表水水樣（S1、S2、S3、S4）進行處理和分析。其中SMR、SM2、SMP、SCP在4個采樣點的檢出率為100%，含量為0．14～1．71ng／L，TMP僅在S4處檢測出，含量為1．44ng／L。由于采樣點S1、S2靠近村莊，SMZ為人體抗菌常用藥，所以含量偏高，分別為8．84ng／L、25．80ng／L。

3 結(jié)論

通過SPE－UPLC－MS／MS法分別對環(huán)境水體中10種磺胺類抗生素進行凈化富集和分析檢測。在優(yōu)化的實驗條件下，10種目標物在1～500μg／L范圍具有良好的線性關系，相關系數(shù)r2在0．9995～0．9999范圍內(nèi)，儀器檢出限和定量限范圍分別為0．01～0．05μg／L和0．05～0．17μg／L，平均水樣加標回收率為77．94%～104．98%，RSD為2．18%～8．09%，方法檢出限＜0．84ng／L。該方法回收率較高、精密度高、重現(xiàn)性好、基質(zhì)干擾低、操作簡單、使用試劑環(huán)境友好，適用于實際環(huán)境地表水中磺胺類抗生素檢測。