基于銀納米粒子－多壁碳納米管／玻碳電極的電化學法測定牛奶粉中三聚氰胺

馬 妍，申 遠，王 川，申貴雋＊，陳章武，王皚琳

（1．大連大學環(huán)境與化學工程學院，遼寧大連116622；2．大連大學人才建設(shè)辦公室，遼寧大連116622）

三聚氰胺（Melamine）分子式為C3N6H6或C3N3（NH2）3，化學名稱為1，3，5－三嗪－2，4，6－三胺，簡稱三胺、蜜胺，為一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物［1］。三聚氰胺的含氮量高達66%，也被稱為“蛋白精”。為此有不法分子用作食品添加劑以提高乳制品中蛋白質(zhì)的含量［2］。毒理學研究顯示，動物長期攝入三聚氰胺會造成泌尿系統(tǒng)損害，引起膀胱及腎結(jié)石，并可進一步引起移行性細胞增生而誘發(fā)膀胱癌［3－4］。嬰兒奶粉添加三聚氰胺事件導致了國內(nèi)乳制品行業(yè)的誠信危機，引起了世界范圍對乳制品添加三聚氰胺的重視。

目前檢測三聚氰胺的方法主要有紫外分光光度法［5－6］、高效液相色譜法［7］、氣相色譜法［8］、色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［9］、毛細管電泳法［10－11］、金納米粒子比色探針法［12－13］等。這些方法中不僅需要昂貴的儀器，復雜的操作流程，而且靈敏度和選擇性都有待于進一步提高。本研究以此為出發(fā)點，制備銀納米－多壁碳納米管修飾玻碳電極（AgNPs－MWCNTs／GCE），用循環(huán)伏安法（CV）在微電解池系統(tǒng)內(nèi)選擇性萃取、測定牛奶粉樣品中的三聚氰胺。該方法簡單、便捷，適于快速萃取和測定牛奶中的三聚氰胺。可為相關(guān)檢測行業(yè)提供新的萃取與檢測方法，也將為有效消除奶制品中的三聚氰胺提供參考。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

CS300型電化學工作站（武漢科思特公司）；三電極體系：玻碳電極（GCE，Φ＝3mm）或修飾玻碳電極為工作電極，飽和Ag／AgCl電極（天津艾達恒晟公司）為參比電極，0．5mm鉑絲電極為對電極；普希科P4－036型筆式酸度計（樂清大倉電子公司）；EX－250能量分散衍射裝置（20kV，10000X，15mm）（日本，HORIBA）；Su 8010超高分辨率場發(fā)射掃描電子顯微鏡（30kV，分辨率1．3nm）（日本，HITACHI）；LAMADA 35分光光度計（美國，PerkinElmer）。

甲醇（色譜純）、無水乙醇（分析純）、氨水（分析純）購于天津市大茂化學試劑廠；三聚氰胺（分析純）、N，N－二甲基甲酰胺（DMF）購于天津市科密歐化學試劑有限公司；AgNO3（分析純，天津市化學試劑二廠）；NaH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液（PBS，自制）；檸檬酸（分析純，天津博迪化工股份有限公司），檸檬酸鈉（分析純，無錫市民豐試劑廠）；三氯乙酸（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；MWCNTs（純度＞95%，Φ＝8～15nm，中國科學院成都有機化學研究所）。實驗用水均為二次蒸餾的去離子水。

1．2 AgNPs－MWCNTs／GCE的制備

1．2．1 電極活化 將GCE在麂皮上依次用1．0、0．3μm Al2O3粉末拋光后，用水、0．1mol／L H2SO4、無水乙醇和水各超聲清洗5min。將清洗后的電極置于5mmol／L的K3［Fe（CN）6］溶液中掃描，直到獲得合適的循環(huán)伏安曲線。將電極保存在水中備用。

1．2．2 AgNPs－MWCNTs復合物的制備 稱取10mg MWCNTs，攪拌分散在15mL的A液中（2mL體積分數(shù)為30%甲醇、6．5mL無水乙醇和6．5mL水，超聲5min除氧）。稱取0．35g AgNO3配成10mL溶液，加入25%的氨水（體積比1∶2）制成B液。然后再將B液在劇烈攪拌條件下逐滴緩慢加到A液中，并保持體系pH在8～9之間，攪拌至反應完全，隔夜沉淀。取下層沉淀離心分離（1 000r／min、10min），水洗滌后再離心兩次至中性（1 000r／min、15min，丙酮洗滌，1 200r／min、5min），取離心后的沉淀物微熱烘干剩余的少量丙酮，轉(zhuǎn)移至干燥密閉容器中保存，備用。

1．2．3 電極制備 準確稱取1mg制備好的AgNPs－MWCNTs復合物于1mL的DMF中，超聲35min至完全均勻分散，用移液槍移取15μL分散液滴涂在干燥潔凈的GCE表面，紅外燈下?lián)]發(fā)溶劑烘干。

圖1 微萃取系統(tǒng)裝置圖Fig．1 Microextraction system1．support；2，3．the extraction reaction cavity；4．work electrode；5．reference to electrode；6．platinum electrode；7．feed inlet；8．liquid outlet．

1．3 電極及微萃取系統(tǒng)的制作與安裝

微萃取系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及安裝圖如圖1所示。該池采用聚甲基丙烯酸甲酯制備而成，上池體和下池體組成一個總高1mm、直徑為11．3mm的內(nèi)圓柱體空腔結(jié)構(gòu)做為萃取反應區(qū)，總體積為100μL。采用三電極體系，將各電極安裝在對應的位置后，與電化學工作站相連接。

通過K3［Fe（CN）6］探針分子考察了該微萃取系統(tǒng)的性能。如圖2所示，隨著微萃取系統(tǒng)體積的增大峰電流略有降低。本次實驗選用的溶液體積均為300μL。

圖2 微萃取系統(tǒng)性能隨體積的變化Fig．2 The dependence of performance of the micro－extraction system on extraction volumes（Curve a：the experiment was operated in our micro－system，curve b：the experiment was conducted under normal volume system1：the working curve between micro－extraction system’s volume and peak current；2and 3：exhibits trends of oxidation peak current and reductive peak current change when the volume of the microextraction system changes from 300，600，900，1 100μL（from top to bottom）．experimental condition：5mmol／L K3［Fe（CN）6］，scan rate：100mV／s，potential range：－0．2－0．6V．

2 結(jié)果與討論

2．1 AgNPs－MWCNTs／GCE制備及工作原理

配制濃度為0．1g／L的三聚氰胺標準溶液，開路富集5min后，運用循環(huán)伏安法進行掃描。掃描電位為－1．0～＋1．0V，掃描速度為100mV／s。反應機理如圖3所示。Ag＋在MWCNTs中被還原成單質(zhì)Ag負載于碳納米管中，通過滴涂的方式附著在GCE表面（圖3上）。在電極表面發(fā)生的氧化還原反應可能是雙電子電子轉(zhuǎn)移過程（圖3下）。經(jīng)由三個N原子上均帶有一個正電荷中間體的產(chǎn)物后發(fā)生電子重排而得到最后的穩(wěn)定產(chǎn)物。三個C原子上均帶有一個正電荷。這可能是Ag＋與三聚氰胺分子之間存在的鍵合作用產(chǎn)生了催化效果［15］。

圖3 AgNPs－MWCNTs／GCE電極的制備流程及其工作原理Fig．3 Diagram of AgNPs－MWCNTs／GCE preparation process and the working mechanism

2．2 AgNPs－MWCNTs性能及其結(jié)構(gòu)的表征

能譜測試結(jié)果如圖4所示。AgNPs－MWCNTs復合物均在3keV處出現(xiàn)Ag的特征峰，且35g／L AgNO3制備的復合物中的Ag含量明顯高于3．5g／L AgNO3制備的復合物的含量，表明成功的在MWCNTs中摻雜了單質(zhì)Ag，而空MWCNTs在3keV處無Ag的特征峰出現(xiàn)，表明空MWCNTs中不含有Ag元素。

將制得的AgNPs－MWCNTs復合物在石英比色皿中用DMF均勻的分散，在白背景下通過數(shù)碼反射成像技術(shù)成像，見圖4內(nèi)插圖。從圖中可以清楚地看到閃亮的光斑和亮點，可能是生成的Ag晶體結(jié)構(gòu)對光發(fā)生反射所致。

通過掃描電鏡（SEM）表征制備的AgNPs－MWCNTs的結(jié)構(gòu)，測試結(jié)果如圖5所示。MWCNTs（圖5a）的SEM圖像中我們可以看出 MWCNTs光滑均勻的纏繞在一起，并沒有雜進入其他的物質(zhì)，制備的AgNPs－MWCNTs（圖5b、c）的SEM圖像中存在大量的亮斑，可見AgNPs部分成功嵌入了MWCNTs的管腔中。且35g／L AgNO3（圖5c）制備的復合物亮斑數(shù)目遠大于3．5g／L AgNO3（圖5b）制備的復合物的數(shù)目，表明用稍高濃度的AgNO3溶液所制備出的電極效果更好。

圖4 MWCNTs及AgNPs－MWCNTs的能譜圖和數(shù)碼反射成像圖Fig．4 Energy spectra and digital reflection image of MWCNTs and AgNPs－MWCNTs

圖5 MWCNTs（a）、AgNPs－MWCNTs（b、c）的掃描電鏡（SEM）圖Fig．5 SEM images of MWCNTs（a）and AgNPs－MWCNTs（b，c）

根據(jù)能譜表征的峰面積結(jié)果分析，得到了在MWCNTs及AgNPs－MWCNTs中Ag元素的質(zhì)量分數(shù)。在制備前MWCNTs中Ag元素含量為0，制備后AgNPs－MWCNTs復合物中Ag的含量變?yōu)?．72%，這表明在MWCNTs中已經(jīng)負載上了Ag。

2．3 電極性能的表征及優(yōu)化

2．3．1 GCE、MWCNTs／GCE和AgNPs－MWCNTs／GCE性能的比較 考察了不同電極對三聚氰胺的響應情況，結(jié)果如圖6所示。裸GCE在三聚氰胺溶液中幾乎沒有響應（曲線c）；當?shù)瓮縈WCNTs后由于導電性能提高使峰電流增大（曲線b）。AgNPs－MWCNTs修飾后，在0．5V處出現(xiàn)了明顯的氧化峰，在0V與－0．3V處出現(xiàn)了兩組還原峰（曲線a）。表明AgNPs－MWCNTs修飾的電極對于三聚氰胺的電化學反應有著一定的催化作用。

2．3．2 MWCNTs滴涂量的優(yōu)化 MWCNTs能顯著增加三聚氰胺的峰電流。實驗表明，電極表面的MWCNTs負載量會對峰電流產(chǎn)生影響。開始氧化峰電流隨MWCNTs量的增加而逐漸增加，這可能是因為電極表面的活性位點隨MWCNTs量的增加而增多。當用量超過15μL時，峰電流反而降低，此時可能是電極表面膜阻礙了三聚氰胺的傳質(zhì)和其與電極之間的電子傳遞速度。因此，滴涂在GCE表面的AgNPs－MWCNTs混合液的最佳用量為15μL。

2．3．3 富集時間的優(yōu)化 在微電解池系統(tǒng)中，將三聚氰胺閉路富集到AgNPs－MWCNTs／GCE修飾電極表面。結(jié)果表明，峰電流隨著富集時間的增加而不斷增大，當富集時間為5min時峰電流不再升高，因此將富集時間選擇為5min。

2．4 標準曲線的繪制

設(shè)置掃描電位區(qū)間為－1～＋1V，掃描速度為100mV／s，運用循環(huán)伏安法，在已優(yōu)化的實驗條件下掃描不同濃度的三聚氰胺標準溶液。記錄峰電流，繪制峰電流隨濃度變化的工作曲線。結(jié)果如圖7所示，三聚氰胺濃度與峰電流分別在1．0×10－4～0．2g／L與0．2～0．8g／L兩個范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較好的線性相關(guān)。其線性方程分別為：I（μA）＝－617．39c（g／L）＋420．65；I（μA）＝－264．64c（g／L）＋352．67，線性相關(guān)系數(shù)分別為R21＝0．9937，R22＝0．9963。

圖6 三聚氰胺在不同電極上的電化學響應Fig．6 Electrochemical response of melamine at different electrodes（a）AgNPs－MWCNTs／GCE；（b）MWCNTs／GCE；（c）bare GCE．0．1g／L melamine solution，scan rate：100mV／s，potential range：－1．0－1．0V．

圖7 三聚氰胺在AgNPs－MWCNTs／GCE上的CV曲線（插圖為峰電流與三聚氰胺濃度的關(guān)系曲線）Fig．7 CV curves of melamine at AgNPs－MWCNTs／GCE（insert is the relationship between peak current and concentration of melamine）1－9：10－4，10－3，10－2，5×10－2，0．1，0．15，0．2，0．4，0．5，0．7，0．8g／L，respectively．scan rate：100mV／s，potential range：－1．0－1．0V．

2．5 三聚氰胺的萃取結(jié)果

運用紫外分光光度法對萃取的結(jié)果進行表征。設(shè)置波長掃描范圍為200～700nm，掃描間隔為1nm。萃取前后最大吸光度的改變情況如圖8所示，曲線a、b分別為萃取前、后的吸收光譜。對比a、b可見，萃取后的吸光度明顯降低。萃取前濃度為0．01g／L，萃取后的濃度經(jīng)計算為2．79×10－3g／L。

2．6 干擾實驗

選取牛奶粉樣品中常見的5種氨基酸（纈氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和賴氨酸）進行干擾性試驗。結(jié)果如圖9所示，三聚氰胺在0．25V左右比所測的氨基酸都少一個氧化峰，且在－0．35V附近與氨基酸相比多出一個還原峰。

圖8 萃取前（a）和萃取后（b）三聚氰胺的紫外光譜圖Fig．8 Ultraviolet spectra of melamine before（a）and after（b）the extraction

圖9 三聚氰胺及不同氨基酸的電化學響應Fig．9 Electrochemical response of the melamine and different amino acids（a）melamine；（b）methionine；（c）phenylalanine；（d）lysine；（e）valine；（f）tryptophan．concentration of solutions：1．0×10－4 g／L，scan rate：100mV／s，potential range：－1．0－1．0V．

2．7 樣品測定

在實際牛奶粉樣品中進行了回收率實驗，樣品處理參照文獻方法［16］。取1g牛奶粉樣品，0．1g三氯乙酸和0．1g CaCl2，用pH＝7的0．1mol／L PBS配制成10mL待測溶液。將其高速離心后，取上層清液并用0．1mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7．0。再次離心后取上層清液進行加標回收率測定。結(jié)果見表1。

表1 牛奶粉樣品中三聚氰胺回收率測定結(jié)果Table 1 Recovery test result of melamine in milk samples

3 結(jié)論

用電化學方法研究了AgNPs－MWCNTs／GCE修飾電極在微電解池中對三聚氰胺的電化學萃取與測定。可能是由于MWCNTs中負載AgNPs后，三聚氰胺氧化還原反應的場所受限制，使該修飾電極與底物產(chǎn)生了一對一的催化效果，進而提高了對該氧化還原反應的催化效率。實驗結(jié)果表明，該方法可以應用于三聚氰胺的萃取和測定。