氮硫摻雜熒光碳點(diǎn)測定菇類食品中維生素B2的研究

李 宏，趙純希，王翰墨，侯朝祥，周繼偉，楊亞玲＊

（1．云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南昆明650200；2．昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

維生素B2（VB2）又名核黃素，屬于水溶性維生素，在中性和酸性溶液中加熱能穩(wěn)定存在。維生素B2是人體所必需的維生素，是體內(nèi)黃酶類輔基的組成部分，參與體內(nèi)許多酶系統(tǒng)的重要輔基的組成，與機(jī)體內(nèi)各種物質(zhì)和能量代謝密切相關(guān)［1］。當(dāng)體內(nèi)維生素B2缺乏時(shí)就會引發(fā)為口、眼等部位的炎癥，表現(xiàn)為口角炎、舌炎、唇炎、眼結(jié)膜炎等［2－3］。體內(nèi)維生素B2的儲存是很有限的，因此機(jī)體都要從食物中攝入。適量的維生素B2攝入能夠保證機(jī)體各種代謝的正常。目前測定維生素B2的方法有多種，例如高效液相色譜法［4－6］、毛細(xì)管電泳法［7］、熒光法［8］、電化學(xué)法［9－11］等。但是這些方法存在有的時(shí)間冗長，有的過程繁雜等不足。

相對于傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)，碳點(diǎn)（Carbon Dots，CDs）具有低毒性、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而受到研究者們的關(guān)注。CDs是一種新型的具有熒光特性的納米碳材料，尺寸較小，一般在10nm以下［12］。由于CDs具有半導(dǎo)體量子點(diǎn)所沒有的優(yōu)點(diǎn)，所以其有廣泛的應(yīng)用前景，包括傳感［13－17］、細(xì)胞成像［18－20］和藥物傳遞［21］。除了一般含有C、N、O元素的CDs外，摻雜CDs也越來越被人們所關(guān)注，例如摻雜N、S、B、P等元素的CDs［22－25］。許多研究表明摻雜CDs具有更高的熒光量子產(chǎn)率［26－27］。近年來，有研究將熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的原理應(yīng)用于維生素B2的測定。鐘文英等［28］用以谷胱甘肽為穩(wěn)定劑合成的ZnSe量子點(diǎn)（供體）與維生素B2（受體）組成FRET體系，確定兩者之間發(fā)生FRET的最佳條件，建立了FRET的熒光猝滅法測定維生素B2的含量。基于FRET測定維生素B2的含量為維生素B2的測定提供了新思路。

本研究用尿素和半胱氨酸通過水熱法合成了同時(shí)摻雜N、S元素的碳點(diǎn)（N，S－CDs），所合成的N，SCDs具有良好的熒光性質(zhì)、水溶性以及較高的熒光量子產(chǎn)率。合成的N，S－CDs用透射電鏡（TEM）、傅里葉變換紅外（FT－IR）光譜、X射線光電子能譜（XPS）等進(jìn)行表征，并將其與維生素B2組成FRET體系用于維生素B2的含量檢測。結(jié)果表明，維生素B2的濃度在1．0×10－7～1．5×10－5mol／L范圍內(nèi)與 N，S－CDs熒光猝滅程度呈良好線性，相關(guān)系數(shù)為0．9911，檢出限為5．0×10－8mol／L。此方法用于實(shí)際樣品檢測，加標(biāo)回收率為97．2%～104．3%，為維生素B2的分析研究提供了一種新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Tecnai G2型透射電子顯微鏡（美國，F(xiàn)EI公司）；EDX－3600B型能譜（XPS）分析儀（江蘇天瑞公司）；UV－2500型紫外－可見分光光度計(jì)（日本，島津公司）；G9800A型熒光分光光度計(jì)（美國，安捷倫公司）；TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜儀（德國，布魯克公司）。

尿素、半胱氨酸、維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素C、谷胱甘肽、葡萄糖、果糖、麥芽糖均購自阿拉丁試劑有限公司；草酸、NaCl、KCl、ZnSO4、CaCl2、CuSO4、MnCl2、FeCl3均購自天津化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純，使用前未經(jīng)任何處理。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

實(shí)驗(yàn)中所用的香菇、冬菇、元菇和杏鮑菇均購買于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 N，S－CDs的合成 分別稱取尿素和半胱氨酸各0．5g，溶于100mL超純水中，然后將溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，置于馬弗爐中，在180℃下反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫。然后將溶液在10 000r／min下離心20min，用0．22μm的濾膜抽濾并將濾液透析24h。所得溶液即為純化的N，S－CDs，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 樣品的前處理 實(shí)驗(yàn)中選擇菇類為檢測對象。將曬干的菇類粉碎，然后稱取2g粉末于燒杯中，加入20mL 0．1mol／L HCl，稱重。加熱煮沸30min，自然冷卻至室溫后，稱重并補(bǔ)足重量。然后滴加3mL 2．5mol／L NaAc，過濾，將濾液定容到25mL的容量瓶中，待用。

1．2．3 維生素B2的檢測 取5μL N，S－CDs溶液于10mL的離心管中，用超純水稀釋到3mL，然后將不同濃度的維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液或經(jīng)過處理的樣品加入其中，并在激發(fā)波長為350nm、發(fā)射波長為440nm下測定熒光強(qiáng)度。

CDs的合成及其檢測維生素B2的機(jī)理圖如圖1所示。

圖1 N，S－CDs的合成及其檢測維生素B2示意圖Fig．1 Schematic illustration of the synthesis of N，S co－doped CDs and application for the detection of vitamin B2

2 結(jié)果與討論

2．1 N，S－CDs的表征以及性質(zhì)研究

圖2A為N，S－CDs的TEM圖，從圖中可以看出合成的N，S－CDs呈球形，且粒徑均勻，分散性較好，粒徑分布如圖2A中插圖所示，大約為2．8±0．4nm。

圖2B為N，S－CDs的FT－IR光譜圖，圖中3 400cm－1處左右的寬峰對應(yīng)O－H、N－H的伸縮振動(dòng)；在2 943、2 306、1 601cm－1處的峰對應(yīng)C－H、S－H 和 C＝O的伸縮振動(dòng)；在1 406、1 118、1 039cm－1處的峰對應(yīng)C－N、C－S和C－O的伸縮振動(dòng)。

圖2C為 N，S－CDs的 XPS的全譜圖，在531．9、400．5、284．3、164．3eV 處有四個(gè)峰，分別對應(yīng)于O 1s、N 1s、C 1s和S 2p。C 1s能譜圖中在284．3、285．1、285．4、286．0、286．5、288．3eV 處的峰分別為C－C、C－H、C－S、C－N、C－O和C＝O的特征峰。N 1s能譜圖中在399．2、401．1eV處的兩個(gè)峰為C－N和N－H的特征峰。O 1s能譜圖中在531．6、532．2eV處的兩個(gè)峰為C＝O和C－O的特征峰。S 2p能譜圖中在163．5、164．8eV處的兩個(gè)峰為S 2p3／2和S 2p1／2的特征峰。XPS的分析結(jié)果基本與FTIR的一致。因此，所合成的N，S－CDs含有羧基、氨基、羥基、巰基等官能團(tuán)，具有良好的水溶性。

圖2 （A）N，S－CDs的透射電鏡（TEM）圖；（B）N，S－CDs的FT－IR光譜圖；（C）N，S－CDs的XPS譜圖Fig．2 （A）TEM image of N，S－CDs；（B）FT－IR spectrum of N，S－CDs；（C）XPS spectrum of N，S－CDs

圖3 （A）為N，S－CDs的紫外－可見吸收光譜和熒光光譜。從圖中可以看出其在236nm和336nm處有兩個(gè)吸收峰，最大發(fā)射波長為350nm，最大激發(fā)波長為440nm。圖（3）B為N，S－CDs在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜圖，當(dāng)激發(fā)波長逐漸增大時(shí)發(fā)射波長無明顯變化，并在激發(fā)波長為350nm處熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。以硫酸奎寧（54%，0．1mol／L H2SO4）為參考物質(zhì)，測得該N，S－CDs的熒光量子產(chǎn)率大約為21%。

圖3 （A）N，S－CDs的紫外－可見吸收光譜和熒光光譜；（B）不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜圖Fig．3 （A）The UV－Vis absorption spectra and fluorescence speatra of the N，S－CDs；（B）Fluorescence emission spectra of N，S－CDs at different excitation wavelengths from 320to 380nm

2．2 N，S－CDs的熒光猝滅機(jī)理

N，S－CDs的熒光發(fā)生猝滅，主要機(jī)理為N，S－CDs和維生素B2之間發(fā)生了FRET。由圖4（A）可知，N，S－CDs最大發(fā)射波長為440nm，維生素B2的激發(fā)光譜在372nm和446nm處有兩個(gè)峰，對應(yīng)的發(fā)射波長為525nm，作為供體的N，S－CDs的發(fā)射光譜與受體維生素B2的激發(fā)光譜有非常好的重疊，這將有利于FRET的發(fā)生。另外，從圖4（B）可知，隨著維生素B2的加入，N，S－CDs的熒光發(fā)生猝滅，而維生素B2的熒光峰增強(qiáng)，所以N，S－CDs和維生素B2之間發(fā)生了FRET。

圖4 （A）維生素B2的激發(fā)光譜（1）、發(fā)射光譜（2）和N，S－CDs的發(fā)射光譜（3）；（B）N，S－CDs不加維生素B2（1）、加低濃度維生素B2（2）和高濃度維生素B2（3）后的熒光光譜圖Fig．4 （A）Excitation（1），emission spectrum（2）of vitamin B2and emission spectrum of N，S－CDs（3）；（B）Fluorescence spectrum of N，S－CDs without vitamin B2（1），with low（2）and high（3）concentration of vitamin B2

2．3 反應(yīng)條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中考察了pH和孵育時(shí)間對N，S－CDs測定維生素B2的影響。如圖5（A）所示，在pH為3～7時(shí)，N，S－CDs的熒光隨著pH的增加而增強(qiáng)，在pH大于7之后，N，S－CDs的熒光強(qiáng)度基本不變。而加入維生素B2后，pH對體系的熒光也有影響，由圖中可以看出，在pH為7時(shí)，N，S－CDs的熒光猝滅程度達(dá)到最大。綜上所述，選擇體系為pH＝7。圖5（B）所示為加入維生素B2后，N，S－CDs的熒光發(fā)生猝滅，并且5min后體系的影響強(qiáng)度幾乎保持不變，所以反應(yīng)時(shí)間選為5min。

圖5 （A）pH對N，S－CDs（1）和反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度（2）的影響；（B）反應(yīng)時(shí)間對體系熒光強(qiáng)度的影響Fig．5 （A）The effect of pH on fluorescence intensity of N，S－CDs（1）and reaction system（2）；（B）The effect of reaction time on the fluorescence intensity

2．4 N，S－CDs熒光猝滅測定維生素B2

圖6 （A）體現(xiàn)了不同濃度的維生素B2對N，S－CDs的熒光強(qiáng)度的影響。從圖中可知隨著維生素B2的濃度逐漸增加，N，S－CDs的熒光逐漸被猝滅。圖6（B）表明維生素B2濃度在0．1～15μmol／L的范圍內(nèi)時(shí)，與N，S－CDs的熒光猝滅程度呈線性關(guān)系，線性方程為：F／F0＝－0．0339c＋0．9006，相關(guān)系數(shù)為0．9911。其中F和F0分別為加入不同濃度維生素B2前后N，S－CDs的熒光強(qiáng)度，c為維生素B2的濃度。

圖6 （A）維生素B2濃度對N，S－CDs熒光強(qiáng)度的影響（插圖：加入不同濃度維生素B2后體系的光譜圖）；（B）F／F0和不同濃度維生素B2之間的線性關(guān)系Fig．6 （A）The effect of different concentration of vitamin B2on the fluorescence intensity of N，S－CDs（Inset：fluorescence spectra of system after the addition of different concentration of vitamin B2）；（B）The linear relationship between F／F0and different concentrations of vitamin B2

2．5 N，S－CDs熒光猝滅測定維生素B2的可行性

考察了N，S－CDs測定維生素B2的可行性。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，相同濃度的維生素A、維生素B1、維生素C、葡萄糖、果糖、麥芽糖、草酸、谷胱甘肽、Na＋、K＋、Zn2＋、Ca2＋、Cu2＋、Mn2＋、Fe3＋對維生素B2的檢測無明顯干擾，因此所制備的N，S－CDs對維生素B2有較好的選擇性，不易受其它可能共存物質(zhì)的干擾。

2．6 實(shí)際樣品檢測

檢測了實(shí)際樣品菇類食品中維生素B2的含量。將樣品按前述方法處理好后用于檢測，每個(gè)樣品平行測定5次。表1為各種菇中維生素B2含量及回收率測定結(jié)果，其中1＃、2＃、3＃和4＃分別為香菇，冬菇，元菇和杏鮑菇。結(jié)果表明加標(biāo)回收率為97．2%～104．3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于5．6%。同時(shí)采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行測定，結(jié)果表明兩種方法沒有明顯差異。因此，此方法可用于菇類食品中維生素B2的測定。

表1 幾種菇中維生素B2的含量測定（n＝5）Table 1 Determination of vitamin B2in mushrooms（n＝5）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中用尿素和半胱氨酸合成N、S共摻雜的N，S－CDs，該N，S－CDs具有良好的熒光特性。將其與維生素B2構(gòu)成熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，用于維生素B2的測定，建立一種檢測維生素B2的方法，具有良好的應(yīng)用前景。