肟化衍生反應(yīng)優(yōu)化及其在聚糖分析中的應(yīng)用

朱文杰，雷家珩，王華偉，林亞維＊

（1．武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430070；2．武漢市洪山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢430060）

糖基化是蛋白質(zhì)修飾的重要手段［1］，而修飾后的蛋白質(zhì)參與到各項(xiàng)生命活動中，如細(xì)胞識別、細(xì)胞免疫、信息傳遞等［2］。糖基化的異常與很多疾病有關(guān)，如腫瘤、糖尿病、心血管病、腎病以及某些遺傳性疾病等［2，3］。因此，針對糖蛋白上的聚糖進(jìn)行分析，對疾病的診斷與治療有著重要的意義。

目前，糖類物質(zhì)常通過分離技術(shù)分離，包括：氣相色譜法（GC）［4］、毛細(xì)管電泳法（CE）［5－6］和高效液相色譜法 （HPLC）［7－8］，并 與 合 適 的 檢 測 技 術(shù) 聯(lián) 用，包 括：紫 外 （UV）［9］、熒 光 （FLD）［10］、蒸 發(fā) 光 散 射（ELSD）［11－12］、脈沖安培（PAD）［13］、質(zhì)譜（MS）［14］和核磁共振（NMR）［15］等。然而，由于糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、離子化效率較低，也不具備生色團(tuán)，不利于進(jìn)行光譜、質(zhì)譜分析［16］。為了克服這一困難，在分析聚糖前，通常需要對聚糖進(jìn)行衍生化處理。常用的方法有：還原胺化［17］、肼衍生［18］、邁克爾加成法［19］、泛甲基化［20］等。還原胺化是最常用的一種衍生方法，常用的衍生試劑有2－氨基苯甲酸（2－AA）、2－氨基苯甲酰胺（2－AB）等［7］。但還原胺化反應(yīng)通常需要在無水的條件下進(jìn)行，且反應(yīng)后需要通過純化除去大量的過量衍生試劑，耗時較長。肟化法是一種較為溫和的標(biāo)記方法，標(biāo)記試劑上的氨基與羰基縮合形成肟式產(chǎn)物，在水溶液中可以穩(wěn)定存在，常被用于聚糖修飾、藥物開發(fā)、材料研發(fā)等［21］。4－氨氧基甲基－7－羥基－香豆素（AOHC）是一種商品化試劑，其具有一個7－羥基取代的香豆素母環(huán)，以及一個可與聚糖還原端反應(yīng)的亞甲基氨氧基基團(tuán)。由于香豆素母環(huán)具有很好的熒光性質(zhì)與疏水性，氨氧基團(tuán)對于聚糖有良好的反應(yīng)活性，因此該試劑可用于聚糖的熒光標(biāo)記以及質(zhì)譜檢測。

本文將AOHC用于聚糖的標(biāo)記及檢測。為了得到最佳的衍生效果，我們首先使用麥芽七糖（DP7）為模型聚糖，依次采用單因素變量法、響應(yīng)面法對衍生反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并且將優(yōu)化后的AOHC衍生方法與傳統(tǒng)的2－AB衍生方法作比較。最終，我們將建立的AOHC衍生化法用于糖蛋白RNase B中聚糖的基質(zhì)輔助激光解吸電離－飛行時間質(zhì)譜（MALDI－TOF MS）分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器、試劑與材料

LC－20AT高效液相色譜儀（日本，Shimadzu公司），附RF－20A熒光檢測器；LS－55熒光分光光度計(jì)（美國，Perkin Elmer公司）；5800MALDI－TOF質(zhì)譜儀（美國，AB SCIEX 公司）；PB－10pH 計(jì)（德國，Sartorius公司）。

4－氨氧基甲基－7－羥基－香豆素（AOHC）由本實(shí)驗(yàn)室自行合成；2，5－二羥基苯甲酸（DHB）、核糖核酸酶B（RNase B）（美國Sigma公司）；肽 N－糖酰胺酶F（PNGase F）（250U，美國 ThermoFisher公司）；10%壬基酚聚氧乙烯醚（NP－40）（美國Biolabs公司）；冰HAc（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；NH4Ac（分析純，北京百靈威科技有限公司）；麥芽七糖（DP7）（純度＞95%，北京百靈威科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO）（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；苯胺（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）。純水（經(jīng)Milli－Q系統(tǒng)純化）。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 AOHC與DP7衍生反應(yīng) 在1mL離心管中，分別加入10μL AOHC（6．0mmol／L），10μL DP7（10μmol／L），10μL苯胺溶液（100mmol／L），10μL 0．2mol／L NH4Ac緩沖溶液（pH＝2．3），充分混合后，放入70℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1h，加入60μL水稀釋，待高效液相色譜－熒光法（HPLC－FLD）分析。色譜檢測條件如下：ZORBAX Eclipse XDB－C18色譜柱（250×4．6mm，5μm，美國 Agilent公司）；流動相：10%乙腈水溶液；等度洗脫；流速：0．4mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20μL。激發(fā)波長：325nm，發(fā)射波長：475nm。

1．2．3 RNase B中聚糖AOHC衍生反應(yīng) （1）10μL RNase B加入90μL Na3PO4溶液，于100℃下加熱10min，冷卻后，加入12μL的10%的 NP－40，靜置30min后，加入0．5μL PNGase F，37℃下反應(yīng)24h后，煮沸5min，加入HAc，于37℃下靜置30min后，用真空濃縮儀干燥。（2）將干燥后的樣品溶于10μL水中，經(jīng)由AOHC衍生后，用于 MALDI－TOF MS分析，AOHC衍生操作見1．2．1。

MALDI－TOF MS測試條件如下：基質(zhì)為DHB；正離子模式；加速電壓20kV；激光強(qiáng)度5 000；質(zhì)量掃描范圍為m／z500～3 000。

2 結(jié)果與討論

2．1 4－氨氧基甲基－7－羥基－香豆素（AOHC）熒光性質(zhì)分析

稱取2．07mg AOHC，溶于1mL DMSO中，再用10%乙腈稀釋至濃度2μmol／L，研究AOHC的熒光性質(zhì)。結(jié)果如圖1（A）所示，其激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為325nm、475nm。以硫酸奎寧為參照，測得AOHC的熒光量子產(chǎn)率為0．63。

2．2 衍生產(chǎn)物的確定

利用HPLC－FLD對AOHC衍生DP7反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測（圖1（B）），在色譜圖上觀察到3個可能產(chǎn)物的色譜峰，保留時間分別為8．0min、12．1min和17．0min。對上述3個色譜峰依次進(jìn)行質(zhì)譜表征，結(jié)果均得到1 364．36Da［M＋Na］＋的衍生產(chǎn)物質(zhì)譜峰（圖1（C））。此結(jié)果表明，AOHC成功對DP7進(jìn)行了標(biāo)記。衍生反應(yīng)產(chǎn)物存在3種異構(gòu)體，包括兩種開環(huán)的肟式結(jié)構(gòu)和閉環(huán)的糖苷結(jié)構(gòu)［15，22］。

2．3 衍生反應(yīng)條件的單因素法優(yōu)化

肟化反應(yīng)是可逆反應(yīng)，其反應(yīng)速度及效率受反應(yīng)條件的影響。本文探究了不同反應(yīng)條件對肟化產(chǎn)物峰面積的影響。衍生試劑用量對衍生反應(yīng)程度有著重要影響。隨著AOHC濃度的增加，衍生產(chǎn)物峰面積隨之增大，當(dāng)AOHC濃度為6mmol／L時，衍生產(chǎn)物峰面積達(dá)到最大，選擇6mmol／L AOHC。肟化反應(yīng)通常需要質(zhì)子催化，一般在酸性條件下進(jìn)行，因此反應(yīng)溶液的pH對衍生反應(yīng)的速度及效率有著重要影響。本實(shí)驗(yàn)探究了不同pH下的衍生產(chǎn)物峰面積變化。隨著pH值的增大，衍生產(chǎn)物峰面積先增大后減小，在pH值為3．5時達(dá)到最大值，單因素實(shí)驗(yàn)中選擇反應(yīng)pH值為3．5。升高反應(yīng)溫度，可以加快反應(yīng)速度，本實(shí)驗(yàn)探究了不同溫度下衍生產(chǎn)物峰面積的變化。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到70℃后，衍生產(chǎn)物峰面積基本不再變化，實(shí)驗(yàn)中選擇反應(yīng)溫度為70℃。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道苯胺可用于催化肟化反應(yīng)［23］。本實(shí)驗(yàn)探究了不同濃度苯胺對衍生效率的影響。隨著苯胺濃度的增大，衍生產(chǎn)物峰面積先增大隨后緩慢下降，本實(shí)驗(yàn)選擇苯胺濃度為100mmol／L。衍生反應(yīng)時間對衍生化程度有著重要影響，本實(shí)驗(yàn)探究了在加入催化劑后衍生產(chǎn)物峰面積隨反應(yīng)時間的變化。反應(yīng)到達(dá)2h后，衍生產(chǎn)物峰面積不再增大，實(shí)驗(yàn)中選擇反應(yīng)時間為2h。

圖1 （A）AOHC熒光光譜圖；（B）AOHC衍生 DP7色譜圖；（C）DP7－AOHC衍生產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig．1 （A）Fluorescence spectrum of AOHC；（B）Chromatogram of DP7after derivatization with AOHC；（C）Mass spectrum of DP7－AOHC derivative

2．4 衍生反應(yīng)條件的響應(yīng)面的優(yōu)化

不同反應(yīng)條件間存在著交互影響作用，為了達(dá)到最佳的衍生效果，我們在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對衍生反應(yīng)條件做進(jìn)一步優(yōu)化。選擇AOHCl濃度為6mmol／L，苯胺濃度為100mmol／L，以反應(yīng)溫度（A，單位為℃）、反應(yīng)時間（B，單位為h）、反應(yīng)pH（C）為變量，以衍生產(chǎn)物峰面積為響應(yīng)值，根據(jù)Box－Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用Design Expert 10響應(yīng)面軟件對衍生反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)行3因素3水平實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Box－Behnken central composite design and the results of experiments

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，模型p＝0．0005＜0．05，表明模型中各影響因素對衍生產(chǎn)物峰面積影響顯著；并且失擬項(xiàng)p＝0．0709＞0．05，失擬項(xiàng)相對于純誤差而言不顯著。該模型的回歸系數(shù)R2＝0．9528，說明該模型擬合程度良好，預(yù)測值與實(shí)測值之間有較好的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)誤差小。應(yīng)用響應(yīng)面交互作用分析對3個因素A、B、C作兩兩交互作用分析，對其作響應(yīng)面圖（圖2）。圖2（A）、2（B）、2（C）分別表明了兩種因素對衍生產(chǎn)物峰面積的的交互影響作用。

圖2 三因素交互影響DP7－AOHC衍生產(chǎn)物峰面積的響應(yīng)面圖Fig．2 Respond surface 3Dplots of peak areas of DP7－AOHC derivative

經(jīng)響應(yīng)面模擬分析可得最佳衍生反應(yīng)條件為：反應(yīng)pH為2．3，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為1h。此條件下的衍生產(chǎn)物峰面積的理論值為1 491 601。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行衍生反應(yīng)，測得衍生產(chǎn)物峰面積為1 522 476，與理論值相比，相對誤差較小（2．07%）。利用響應(yīng)面法得到的最優(yōu)衍生條件可靠，因此可以直接用于樣品的分析檢測。

2．5 方法比較

在相同的DP7濃度下，分別用AOHC衍生化法和2－AB衍生化法對DP7進(jìn)行衍生，對兩種衍生方法測得的色譜峰面積進(jìn)行比較，AOHC衍生DP7的衍生產(chǎn)物峰面積是2－AB衍生DP7的衍生產(chǎn)物峰面積的3．81倍。此結(jié)果表明，AOHC衍生具有很好的靈敏性。傳統(tǒng)2－AB衍生化法需在無水條件下反應(yīng)2h，且反應(yīng)后需要通過純化除去大量過量的標(biāo)記試劑，而AOHC衍生化法則是在水溶液中反應(yīng)1h，反應(yīng)后無需純化，可直接進(jìn)行色譜、質(zhì)譜分析。因此，AOHC衍生化法較傳統(tǒng)的2－AB衍生化法具有明顯的優(yōu)勢。

2．6 實(shí)際樣品分析

將優(yōu)化后的AOHC衍生化法用于衍生RNase B中的聚糖，利用MALDI－TOF MS進(jìn)行檢測分析，如圖3所示，檢測到RNase B中所有5種聚糖。此結(jié)果表明，AOHC衍生在生物樣品中有著很好的應(yīng)用。

圖3 AOHC標(biāo)記RNase B質(zhì)譜圖Fig．3 Mass spectrum of RNase B after AOHC labeling

3 結(jié)論

本文利用新型熒光衍生試劑4－氨氧基甲基－7－羥基－香豆素對聚糖進(jìn)行衍生，發(fā)展了一種新的聚糖分析方法。本工作中我們分別采用響應(yīng)面法和單因素法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立的方法與傳統(tǒng)的2－AB衍生化法相比，具有快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)勢。采用該方法，我們成功分析了糖蛋白RNase B中的聚糖，結(jié)果顯示AOHC標(biāo)記法在聚糖分析中有著很好的應(yīng)用前景。