超高效液相色譜－串聯質譜法同時測定生物體液中的酪氨酸及其代謝產物

梁先玉，李 斌，萬益群＊，2

（1．南昌大學化學學院，江西南昌330031；2．南昌大學分析測試中心，江西南昌330047）

酪氨酸為芳香族氨基酸，它是構成人體蛋白質的重要氨基酸之一［1－2］，在生物體內會代謝出多種物質［3－4］，其代謝通路如圖1所示［5］。研究表明，多種疾病的發生與酪氨酸代謝發生紊亂有一定的相關性［6－13］。因此，研究并構建生物體液中酪氨酸及其代謝產物的分析新技術，探討酪氨酸及其代謝產物與癌癥，特別是早期癌癥的關聯性具有重要意義。目前，酪氨酸及其多種代謝產物的檢測方法主要有光譜法［14－15］、離子交換色譜法［16－17］、高效液相色譜法［18－21］、毛細管電泳法［22－23］和氣相色 譜－質 譜法［24－25］等。這些方法各有其特點，如光譜法設備廉價、操作簡單但選擇性差，靈敏度也相對較低。生物體液基質較為復雜，因此，要實現低含量目標物的準確定量，必須選擇性能更好的分離分析技術。超高效液相色譜－串聯質譜法（UPLC－MS／MS）選擇性好、靈敏度高，在復雜基質中痕量組分的分析測定方面已得到廣泛應用。

為了系統地探討乳腺癌在發生發展過程中生物體液中酪氨酸及其代謝產物水平變化規律，本文應用UPLC－MS／MS聯用技術，研究了酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、對 羥苯基乙 酸（4－Hydroxyphenylacetic Acid，PHPAA）、對羥苯基丙酸（3，4－Hydroxyphenylpropionic Acid，PHPA）、對羥苯基乳酸（4－Hydroxyphenyllactic Acid，PHPLA）、酪胺（4－Hydroxyphenylamine，HA）和多巴（3，4－Dihydroxyphenylalanine，DOPA）的色譜分離及質譜檢測條件，構建了這些化合物同時分離分析新技術，并用于大鼠尿液分析，為后續研究酪氨酸及其代謝產物與乳腺癌的關聯性奠定方法學基礎。

圖1 酪氨酸及其代謝產物代謝通路Fig．1 Metabolic pathway of tyrosine and its metabolites①Tyrosine decarboxylase（EC：4．1．1．25）；②Tyrosinase（EC：1．14．18．1）；③Tyrosine hydroxylase（EC：1．14．162）；④Tyrosine transaminase（EC：2．6．1．5）；⑤Hydroxyphenylpyruvate reductase（EC：1．1．1．237）；⑥4－Hydroxyphenyllactate dehydrogenase（EC：1．1．1．222）；⑦4－Hydroxyphenylpyruvate decarboxylase（EC：4．1．1．80）；⑧Aryl－aldehyde dehydrogenase（EC：1．2．1．29）．

1 實驗部分

1．1 主要儀器與試劑

S30液相色譜儀（日本，島津公司）；5600＋質譜儀（美國，AB公司），配有電噴霧（ESI）離子源；pHS－3C酸度計（上海雷磁儀表廠）。

標準品：酪氨酸（Tyr）（＞99%）、酪胺（HA）（＞97%）和對羥苯基丙酸（PHPA）（＞98%）購于美國 Acros Organics公司；對羥苯基乙酸（PHPAA）（＞98%）和多巴（DOPA）（＞97%）購于東京Chemical Industry公司；對羥苯基乳酸（PHPLA）（＞98%）購于美國Sigma－Aldrich公司。乙腈和甲醇（色譜純）購于美國LiChrosolv公司；乙酸（色譜純）購于TEDIA公司；乙酸銨（色譜純）購于美國Anaqua Chemicals公司。實驗用水（18．2MΩ·cm）取自于英國ELGA LabWater公司的PURELAB Option－Q純水／超純水系統。

1．2 標準溶液的配制

分別準確稱取5．0mg的酪氨酸及其代謝產物標準品，置于10mL容量瓶中，用1%的甲酸溶解并定容，搖勻，配制成500mg／L的標準儲備溶液，置于冰箱內4℃保存。使用時用pH＝5．7的HAc－NH4Ac緩沖溶液稀釋至所需濃度。

1．3 色譜分析條件

色譜柱：Shim－pack GIST C18快速分離柱（75×2．1mm，2μm；SHIMADZU）；流動相：20mmol／L HAc－NH4Ac緩沖溶液（pH＝5．7）∶乙腈＝95∶5（V／V）；流速：0．2mL／min；自動進樣器樣品盤控溫：4℃；柱溫：室溫；進樣量：5μL；采樣時間：正離子模式5min，負離子模式10min。

1．4 質譜條件

Eksigent 415（425）－Triple TOF 5600＋系統在多反應監測（MRM）模式中既可以正離子（＋）進行操作，也可以負離子（－）進行操作。各化合物的質譜分析參數見表1。

表1 Tyr、DOPA、PHPLA、PHPA、PHPAA和HA的質譜分析參數Table 1 Multiple reaction monitoring parameters for determination of Tyr，DOPA，PHPLA，PHPA，PHPAA and HA

1．5 樣品采集及前處理

取5周齡SD級別的雌性大鼠（購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），常規飼養，每周采集大鼠尿樣。取一定量的尿樣加入等體積超純水，振蕩搖勻，以12 000r／min離心10min。取上清液，過0．22μm水系濾膜后，進樣分析測定。

2 結果與討論

2．1 色譜條件優化

本文主要探討了以乙腈和HAc－NH4Ac緩沖溶液作為流動相，考察在不同濃度的緩沖溶液、不同pH值和不同有機相比例條件下，酪氨酸及其代謝產物的色譜分離情況。結果表明，當乙腈與20mmol／L HAc－NH4Ac緩沖溶液（pH＝5．7）體積比為5∶95時，酪氨酸及其代謝產物色譜峰的拖尾現象減少，峰形改善，分離效果最好，結果如圖2所示。

2．2 質譜條件優化

在正、負離子兩種模式下，分別對酪氨酸及其代謝產物標準溶液進行全掃描，掃描范圍為m／z60～1 000，得到每種物質的分子離子峰。以該分子離子峰為母離子，在10～80V范圍內，分別對其裂解電壓進行優化，得到每個物質最佳母離子信號。然后，分別對每個物質進行二級質譜掃描，并優化其碰撞能。優化的質譜分析條件見表1。

2．3 樣品前處理方法優化

大鼠尿液基質復雜，可能對待測物的分析造成較大干擾。為了保證分析結果的準確性，在進行測定之前，需要對大鼠尿液進行處理。實驗取1mL尿液，分別加入3mL、2mL和1mL超純水，以12 000r／min離心10min，取上清液過0．22μm水系濾膜后進樣分析。結果表明，加入3mL和2mL超純水，尿液中含量較低的酪氨酸代謝產物不易檢出。因此，實驗選擇在尿液中加入1mL超純水進行處理并檢測。

圖2 酪氨酸及其代謝產物的總離子流（TIC）色譜圖Fig．2 TIC chromatograms of standard mixture solution of tyrosine and its metabolites（1）4－hydroxyphenethylamine；（2）tyrosine；（3）3，4－hydroxyphenylpropionic acid；（4）3，4－dihydroxyphenylalanine；（5）4－hydroxyphenyllactic acid；（6）4－hydroxyphenylacetic acid．

2．4 樣品盤溫度的優化

大鼠尿液基質復雜，樣品盤溫度對目標物的分析可能會有一定影響。實驗對自動進樣器樣品盤溫度進行了優化，發現尿液中酪氨酸及其5種代謝產物在不同樣品盤溫度下的響應信號變化情況不同。其中，酪氨酸、對羥苯基乳酸、對羥苯基乙酸、對羥苯基丙酸和酪胺隨溫度的變化其響應信號基本不變，而多巴則會發生變化。圖3是樣品盤溫度對尿液中多巴含量測定的影響。實驗結果顯示，當樣品盤溫度大于4℃時，尿液中多巴的響應信號會發生較大改變。有研究表明，溫度對尿液pH 值［26］、黏度［27］、肌酸含量［28］和尿蛋白與肌酐比［29］等都有一定影響。實驗采用全掃模式對多巴標準品在不同樣品盤測定溫度條件下的穩定性進行了分析。結果顯示，多巴標準品色譜峰面積隨溫度的變化不大，且未發現有新的物質生成，表明多巴標準品在不同溫度下的穩定性較好。然而，對于尿液，當樣品盤溫度大于4℃時，由于其基質復雜，溫度變化可能對尿液的性質產生了一定影響，進而可能對大鼠尿液中多巴的響應信號產生了抑制作用，從而導致多巴檢測信號不穩定。當樣品盤溫度為4℃時，不會產生上述現象。因此，本實驗選擇樣品盤溫度為4℃。

圖3 大鼠尿液中多巴在不同樣品盤溫度條件下的變化情況Fig．3 Changes of 3，4－dihydroxyphenylalanine in rat urine at different temperature of automatic samplera：4℃；b：6℃；c：15℃．

2．5 基質效應

基質效應會導致檢測結果產生偏差［30－31］。本文用空白樣品基質溶液配制成不同濃度的基質混合標準溶液（現配現用），制作基質匹配加標標準曲線?；|效應＝基質匹配加標標準曲線斜率／溶劑加標標準曲線斜率，斜率比越接近于1，基質效應越?。?2－33］。實驗結果表明（表2），基質效應對檢測結果的影響較大。因此，實驗采用基質加標標準曲線對待測大鼠尿液進行分析。

2．6 線性方程和檢出限

用大鼠尿液將酪氨酸及其代謝產物的標準儲備液配制成一系列不同濃度的混合基質標準工作溶液，在優化的條件下進行分析檢測。采集各化合物色譜數據中的峰面積（A）與待測物的濃度（c）的數據，繪制基質標準曲線。結果表明，酪氨酸及其代謝產物的線性關系良好，檢出限在0．0003～0．0041mg／L之間，線性范圍和線性回歸方程如表3所示。

表2 純溶劑加標標準曲線與基質加標標準曲線之間的對比Table 2 The comparison between the standard curve of the analytes prepared in the pure solvent and in the matrix

表3 酪氨酸及其代謝產物的線性方程及檢出限Table 3 Linear equations，correlation coefficients（R2），limits of detection（LODs）and limits of quntification（LOQs）for tyrosine and its metabolites

2．7 回收率與精密度

分別添加不同濃度水平的目標物至大鼠尿液中進行加標回收實驗。在已優化的分離分析條件下進行檢測，結果如表4所示。實驗結果顯示，酪氨酸及其代謝產物的回收率在82．0%～113．0%之間，相對標準偏差（RSD）小于4．4%。以上結果表明，該方法準確可靠，可用于大鼠尿液中酪氨酸及其代謝產物的分析檢測。

表4 大鼠尿液中目標分析物的加標回收結果（n＝6）Table 4 Recovery of analytes in rat urine（n＝6）

2．8 樣品分析

采用所建立的分析方法對大鼠尿液進行分析，結果如表5所示。由表5可知，大鼠尿液中共檢測到酪氨酸、對羥苯基乳酸、對羥苯基乙酸和酪胺4種化合物，RSD小于3．9%，未檢測到多巴和對羥苯基丙酸。這可能與多巴和對羥苯基丙酸在大鼠尿液中的含量較低有關。

表5 大鼠尿液中酪氨酸及其代謝產物的分析結果（n＝4）Table 5 Analytical results of tyrosine and its metabolites in rat urine（n＝4）

3 結論

本文研究構建了大鼠尿液中酪氨酸及其多種代謝產物同時分析測定的超高效液相色譜－串聯質譜新方法。結果表明，該方法樣品前處理簡單，檢測限在0．0003～0．0041mg／L之間，靈敏度較高；三個濃度水平的加標回收率在82．0%～113．0%之間，驗證了所建立的方法的可行性。該方法可用于實際尿液分析，為進一步探討酪氨酸及其代謝產物與某些疾病相關性提供了方法學參考。