凝結芽孢桿菌中耐熱木酮糖激酶基因的克隆表達及生信分析

聶 恬，孟未群，李夢然，張玉明，倪志華*

（河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

利用秸稈、木材等可再生資源生物煉制生物基產品是生物技術領域的研究熱點，其技術關鍵是葡萄糖和木糖的高效生物轉化。與代謝葡萄糖不同，微生物對木糖利用率普遍不高。細菌中木糖分解代謝涉及兩種重要的酶：木糖異構酶（EC 5.3.1.5）和木酮糖激酶（EC 2.7.1.17）。木糖異構酶將木糖代謝為木酮糖，然后由木酮糖激酶將其轉化為木酮糖5-磷酸后進入磷酸戊糖途徑或磷酸解酮酶途徑以分解代謝[1]。微生物中木酮糖激酶的克隆表達與理化性質的研究已有大量報道[2-3]。通常，來源于耐/嗜熱微生物的酶具有耐微生物污染、催化能力強和高溫穩定等優點，在工業催化領域獨具優勢[4]。AHMAD S等[5-6]對兩株耐熱菌Saccharococcus caldoxylosilyticus和海棲熱袍菌（Thermotogamaritima）中的木酮糖激酶進行了系統研究，獲得了高活性、耐高溫的催化酶。

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）具有高溫發酵木糖和葡萄糖生產乳酸的能力[7-8]，已經成功應用于秸稈、淀粉等可再生資源的生物煉制[9-10]，對其所含功能酶的克隆、表達和純化研究已經多有報道[11-14]。然而，針對該菌種的木糖代謝機制的研究還很匱乏。ZHENG Z等[15]首次從木糖操縱子角度，研究了B.coagulans NL01中的木酮糖激酶，然而未對該酶的結構特點和耐熱機制進行研究。

B.coagulans IPE22是本實驗室分離鑒定的一株乳酸生產菌，可高溫發酵木糖生產L-乳酸[16]，說明該菌株中一定具有高效的木糖代謝酶系。因此，本研究擬對B.coagulans IPE22中木酮糖激酶基因Bc-XK進行克隆表達和生物信息學分析，并對其熱穩定性進行研究，最后將木酮糖激酶Bc-XK與其它細菌來源的木酮糖激酶進行氨基酸序列比對、活性位點分析和系統發育樹聚類分析，旨在闡述該酶的耐熱機制，為其工業化應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）IPE22、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）：本實驗保存。

1.1.2 培養基

固體LB培養基：胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化鈉1%、瓊脂粉1.5%，121℃高壓滅菌20min。液體LB培養基中不添加瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑

載體pET-30a：美國Novagen公司；His-Trap鎳親和層析柱：美國GE health公司；細菌基因組（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、質粒小提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker、蛋白質Marker、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、限制性內切酶NcoI（10 U/μL）和XhoI（10U/μL）、T4DNA連接酶（350U/μL）：寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

5430型臺式高速離心機：德國艾本德公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇潔凈化設備有限公司；PowerPac 300電泳儀：美國伯樂公司；2720型PCR基因擴增儀：美國ABI公司；MLS-3750型全自動滅菌鍋：日本三洋公司；Scientz-IID型超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木酮糖激酶基因Bc-XK的克隆

將B.coagulans IPE22接種于LB液體培養基中，45℃、150 r/m in條件下培養16 h，離心，收集菌體，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取B.coagulans IPE22基因組DNA。根據美國國立生物技術信息中心（national center forbiotechnology information，NCBI）GenBank數據庫中B.coagulans 36D1（登錄號：CP003056.1）的木酮糖激酶基因信息設計基因Bc-XK的PCR擴增引物，正向引物為5'-CATGCCATGGCTATGAAATATGCAATCGGTGTC-3'，反向引物為5'-CCGCTCGAGCGGTTAAATTTCATCTGTTTTCCCT-3'。引物中，下劃線部分為限制性內切酶位點NcoI（正向引物）和XhoI（反向引物）。以基因組DNA為模板，采用設計的引物進行聚合酶鏈式反應（polymerasechain reaction，PCR）擴增，PCR擴增體系和擴增條件參考文獻[11]。PCR擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.3.2 重組菌的構建

PCR擴增產物經純化后，采用限制性核酸內切酶NcoI和XhoI分別對純化的PCR擴增產物和質粒pET-30a進行雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化目的片段。采用T4DNA連接酶連接酶切產物，以獲得重組質粒pET-30a-Bc-XK。采用氯化鈣法[17]將重組質粒pET-30a-Bc-XK轉化至E.coli BL21（DE3）宿主菌中，涂布于含有25mg/L卡那霉素的LB平板上，于37℃條件下倒置培養18 h。挑取陽性克隆子送至蘇州金唯智公司進行測序。

1.3.3 Bc-XK基因的表達

將重組菌E.coli BL21 pET-30a-Bc-XK接種于LB液體培養基中，37℃、200 r/min條件下培養至OD600nm值約0.6后，添加終濃度為0.5mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）誘導表達。繼續培養8 h后，8 000 r/min離心10min，收獲菌體。

1.3.4 重組酶Bc-XK的純化

獲得的菌體在冰水浴中進行超聲破壁，超聲條件為功率95W，12m in，2 s工作，2 s間隔，360個循環。細胞破碎液在4℃、10 000 r/min條件下離心15min，棄沉淀，取上清液，使用鎳柱進行蛋白純化[4]。采用10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測重組酶Bc-XK的分子質量。

1.3.5 木酮糖激酶活性檢測及熱穩定性研究

參照文獻[15]測定木酮糖激酶活性。將酶促反應體系分別置于50℃、60℃和70℃，每隔60min測定一次木酮糖激酶活性，以相對酶活力表示。相對酶活力定義為殘留酶活力與未經熱處理的初始酶活力之比值。

1.3.6 分析方法

參照《生物信息學》[18]進行生物信息學分析。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和NetPhosBac（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosBac/）對Bc-XK基因及其編碼的氨基酸序列進行理化性質分析；采用Prositeexpasy（https：//prosite.expasy.org/）預測Bc-XK基因編碼蛋白的二級結構；采用NCBI-CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/w rpsb.cgi）分析蛋白質保守結構域和功能位點；采用SW ISS-MODEL（https：//sw issmodel.expasy.org/interactive）預測高級結構。

從NCBI中選取15株細菌的木酮糖激酶氨基酸序列，使用MEGA X 10.0.5軟件將其與Bc-XK氨基酸序列進行比對分析。基于木酮糖激酶氨基酸序列，采用最大似然（maximum likelihood，ML）法構建系統發育樹。利用Timetree數據庫（http：//www.timetree.org/）對木酮糖激酶來源物種系統進化地位進行分析。

2 結果與分析

2.1 木酮糖激酶基因Bc-XK的克隆

以B.coagulans IPE22基因組為模板進行PCR擴增，PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。由圖1可知，PCR擴增產物堿基長度約為1 500 bp，與Bc-XK基因的預期片段大小相符合。

圖1 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gelelectrophoresis of PCR amplification product

2.2 重組酶Bc-XK的表達與純化

重組菌E.coli BL21 pET-30a-Bc-XK經IPTG誘導、表達后，對重組酶Bc-XK進行純化和SDS-PAGE分析，結果見圖2。由圖2可知，重組菌E.coli BL21 pET-30a-Bc-XK經IPTG誘導表達，獲得重組酶Bc-XK，其分子質量為56 kDa，該結果與生物信息學預測結果一致。經鎳柱純化后，重組酶Bc-XK條帶單一，達到電泳純，比酶活力為（20.56±3.31）U/mg。

圖2 粗酶液和重組蛋白的SDS-PAGE結果Fig.2 SDS-PAGE results of crude enzyme and recombinant protein

2.3 重組酶Bc-XK的熱穩定性研究

B.coagulans IPE22可高溫發酵木糖生產乳酸，對源于其的重組酶Bc-XK進行溫度穩定性研究結果如圖3所示。由圖3可知，Bc-XK在50℃穩定性非常好；當溫度為60℃時，重組酶Bc-XK也表現出良好的穩定性，在180min內幾乎沒有活性損失；當溫度為70℃時，孵育180min后，重組酶Bc-XK的相對酶活力為（39±3.1）%。說明重組酶Bc-XK具有良好的熱穩定性，在工業上具有潛在的應用價值[19-20]。并且，可以利用基因工程方法將Bc-XK基因轉入其他具備生物煉制能力的細菌或酵母中，實現微生物對木質纖維素中葡萄糖或木糖的全利用[21]。

圖3 重組酶Bc-XK的熱穩定性Fig.3 Thermalstability of recombinase Bc-XK

2.4 重組酶Bc-XK的生物信息學分析

2.4.1 重組酶Bc-XK的結構分析

將Bc-XK基因的核苷酸序列信息提交至NCBI的Gen-Bank數據中，登錄號為MF543361。利用ProtParam對Bc-XK基因進行分析，結果表明，Bc-XK基因含有堿基長度為1 536 bp的一個開放閱讀框，共編碼511個氨基酸（登錄號：ATB56311.1），該基因編碼的蛋白質等電點為5.46。

經Prosite-expasy和NetPhosBac預測，重組酶Bc-XK為親水蛋白質，含有4個N-糖基化位點和多個磷酸化位點。基于Prosite-expasy的蛋白質二級結構預測結果顯示，重組酶Bc-XK中α-螺旋、無規卷曲和延伸鏈含量豐富，分別為38.16%、43.25%和18.59%。

利用NCBI-CDD分析重組酶Bc-XK的保守結構域，結果如圖4A所示。由圖4A可知，重組酶Bc-XK含有多個木酮糖結合位點、金屬結合位點和鎂三磷酸腺苷（magnesium adenosine triphophate，MgATP）結合位點，這與FLANAGAN T等[22]的研究結果一致。同時，重組酶Bc-XK中含有墨角藻糖激酶-葡萄糖酸激酶-甘油激酶-木酮糖激酶（fucolokinase-gluconokinase-glycerolkinase-xylulokinase，FGGY）結構域和氮端核苷酸結合域-糖激酶-熱休克蛋白-肌動蛋白（N-terminalnucleotidebinding domain-sugarkinase-heatshock protein-actin superfam ily，NBD-sugar-kinase-HSP70-actin su-perfamily）超家族結構域。重組酶Bc-XK中具有的FGGY結構域是激酶典型的結構特點，與E.coli中木酮糖激酶類似[23]。NBD-sugar-kinase-HSP70-actin結構域中熱休克蛋白（heatshock protein，HSP）具有輔助熱變性蛋白質恢復高級結構的功能，因此，推測重組酶Bc-XK中的HSP結構域可能與其高溫催化特性有關。

使用SWISS-MODEL預測重組酶Bc-XK的高級結構，結果見圖4B。由圖4B清晰可見酶的催化位點：天冬氨酸-8、蘇氨酸-11和天冬氨酸-239。并且，圖4B中也顯示了Bc-XK中底物（木酮糖）結合區域與催化位點相鄰，這與NCBI-CDD預測結果一致。

圖4 重組酶Bc-XK的保守結構域（A）和高級結構（B）預測結果Fig.4 Forecasted results of conserved domains(A)and advanced structure(B)of recombinase Bc-XK

2.4.2 重組酶Bc-XK的活性位點分析

為了研究蛋白質結構與功能的關系，使用ClustalX2軟件將重組酶Bc-XK與海棲熱袍菌（Thermotogamaritima）中的木酮糖激酶Tm-XK、模式生物大腸桿菌（E.coli）中的木酮糖激酶Ec-XK和常見工業乳酸生產菌短乳桿菌（Lactobacillusbrevis）中的木糖激酶Lb-XK的氨基酸序列進行比對分析，結果見圖5。

由圖5可知，木酮糖激酶Bc-XK與Tm-XK、Ec-XK和Lb-XK的氨基酸序列相似性分別為38%、38%和57%，且4個木酮糖激酶均含有27個活性位點，包括3個催化位點（見圖4）：天冬氨酸-8、蘇氨酸-11、天冬氨酸-239；2個金屬結合位點：天冬氨酸-8、天冬氨酸-239；7個木酮糖底物結合位點：谷氨酰胺-80、甲硫氨酸-81、組氨酸-82、色氨酸-100、天冬氨酸-239、天冬酰胺-240、甲硫氨酸-294；21個MgATP結合位點：天冬氨酸-8、甘氨酸-10、蘇氨酸-11、絲氨酸-12、絲氨酸-13、賴氨酸-15、天冬氨酸-239、異亮氨酸-259、甘氨酸-260、蘇氨酸-261、甘氨酸-301、酪氨酸-302、亮氨酸-304、絲氨酸-305、苯丙氨酸-317、丙氨酸-318、亮氨酸-320、甘氨酸-402、甘氨酸-403、甘氨酸-404、絲氨酸-407。

圖5 重組酶Bc-XK與其他木酮糖激酶氨基酸序列比對與活性位點分析Fig.5 Am ino acid sequence alignm ent and active sites analysis between recombinase Bc-XK and other xylulose kinase

值得指出的是，木酮糖激酶Bc-XK與Tm-XK雖然都是耐熱木酮糖激酶，但是其氨基酸序列相似性不高。木酮糖激酶Bc-XK和Tm-XK的27個活性位點中存在7個差異位點（絲氨酸-12、異亮氨酸-259、甘氨酸-301、絲氨酸-305、苯丙氨酸-317、丙氨酸-318和亮氨酸-320），且僅涉及MgATP結合位點功能區域，而其他活性位點（木酮糖結合位點、催化位點和金屬結合位點）均相同。一般而言，決定酶促反應機制的關鍵位點是催化位點[22]。木酮糖激酶Bc-XK與Tm-XK的催化位點完全相同，均為天冬氨酸-8、蘇氨酸-11和天冬氨酸-239。因此，木酮糖激酶Bc-XK和Tm-XK具有類似的催化機制。推測木酮糖激酶Bc-XK和Tm-XK在MgATP結合位點存在的差異僅會導致底物結合能力變化，影響酶的催化反應速度高低。

2.4.3 木酮糖激酶Bc-XK的遺傳學分析

重組酶Bc-XK的系統發育樹見圖6A。由圖6A可知，16個木酮糖激酶聚為4個類群（I、II、III和IV）。其中，類群I由來自芽孢桿菌屬（Bacillus）的木酮糖激酶組成；類群II和III由來自乳酸細菌的木酮糖激酶組成；類群IV由來自T.maritim e、T.neapolitana和E.coli中的木酮糖激酶組成。為了驗證基于木酮糖激酶氨基酸序列構建的系統發育樹是否與物種的進化地位一致，基于Timetree數據庫，對本研究涉及的14個物種進行分析[24]，結果如圖6B所示。由圖6B可知，涉及的14個物種聚類為4個類群：類群I為包括凝結芽孢桿菌在內的5株芽孢桿菌屬細菌；類群II均為乳酸細菌；類群III為E.coli；類群IV為兩種嗜熱細菌（T.maritime和T.neapolitana）。與圖6A結果類似，說明基于木酮糖激酶構建的系統發育樹可以很好的反映出物種的進化關系。從系統進化和發育角度而言，雖然Bc-XK不是一個嶄新的催化酶，但是其具有良好的高溫催化能力和優異的熱穩定性，在工業上亦具有廣闊的應用價值。

圖6 基于木酮糖激酶氨基酸序列的系統發育樹（A）和基于物種的時間樹（B）Fig.6 Phylogenetic tree based on am ino acid sequence ofxylulose kinase(A)and time tree based on species(B)

2.5 基于生物信息學分析木酮糖激酶Bc-XK熱穩定性機理

有研究報道，耐熱蛋白質富含帶電氨基酸殘基；高級結構中α-螺旋結構較多且肽鏈長；與α-螺旋形成有關的丙氨酸含量高；富含金屬離子結合位點等[25-26]。通過生物信息學分析可知，木酮糖激酶Bc-XK中帶電氨基酸（精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）共有112個，占總氨基酸數量21.92%；分子中易于形成α-螺旋的丙氨酸含量位于所有氨基酸組成的第3位，比例為7.80%；高級結構中α-螺旋含量較高，且含有2個金屬結合位點。因此，木酮糖激酶Bc-XK具有較好的熱穩定性。

3 結論

菌株B.coagulans IPE22中的木酮糖激酶基因Bc-XK與載體pET-30a連接后，成功在E.coli BL21（DE3）中誘導表達。重組酶Bc-XK經純化后，比酶活力為（20.56±3.31）U/mg。該酶熱穩定性好，可以在60℃保持活力180min以上。生物信息分析結果顯示，基因Bc-XK含有一個1 536bp的開放閱讀框，共編碼511個氨基酸，其編碼的蛋白質為親水蛋白，分子質量為56 kDa，等電點為5.46，二級結構中α-螺旋、無規卷曲和延伸鏈含量豐富，3個催化位點為天冬氨酸-8、蘇氨酸-11、天冬氨酸-239。氨基酸序列比對和聚類分析結果顯示，不同細菌來源的木酮糖激酶具有高度保守的3個催化位點，且基于木酮糖激酶構建的系統發育樹可以很好的反映出物種的進化關系。