Box-Behnken中心組合設計優化復合豆漿酒發酵工藝

周書來，王 琪，劉琨毅*，張婉琪，吳 麗

（1.樂山職業技術學院 藥學系，四川 樂山 614000；2.宜賓職業技術學院 五糧液技術學院，四川 宜賓 644003；3.樂山豐野農業科技有限責任公司，四川 樂山 614000；4.樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

我國傳統的乳酒都是以馬奶或羊奶為原料，以開菲爾粒或酵母菌與乳酸菌的混合菌為發酵劑生產的一類含酒精的飲品[1-4]。市場上銷售的乳酒，往往存在酸度普遍偏高的不良特性[5-8]。利用豆類原料制得的豆漿與馬奶或羊奶相比，含有較為豐富的植物蛋白質及營養物質，是馬奶或羊奶理想的替代品，也是近年來研究的熱點[9-11]。豆漿酒作為一種含有酒精的復合飲料，既補充了我國居民因牛乳等動物蛋白攝入不足的缺陷，又比傳統的乳酒口感更加柔和[12-14]。

復合型發酵酒是使用兩種或兩種以上的釀酒原料發酵而成的酒品，其能綜合兩種或兩種以上原料的特點與優勢，彌補利用單一原料釀酒在色、香、味上的欠缺和營養成分不足等缺陷[15-16]。因復合型發酵酒利用了多種釀造原料，并采用先進的釀造工藝，使其風味獨特，深受消費者的喜愛[8，16]。黃豆因其含有豐富的蛋白質、微量元素及異黃酮類物質，因而成為制作豆漿的主要原料[17]。然而，傳統豆漿中存在的豆腥味極大限制了其應用和推廣[18-19]。綠豆是我國傳統藥食兼用的食材，有“食中佳品，濟世長谷”之美稱，具有清熱、消暑、解毒、保肝等功能。雖然傳統煮制工藝中綠豆溶出物含量較黃豆低，但其豆腥味卻沒有黃豆漿明顯[20-21]。符楨華等[13]利用豆漿制作的豆漿酒能在一定程度上消除豆漿制品豆腥味，為豆類原料制作酒類產品提供了新的思路。

本試驗以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為發酵劑，通過黃豆漿與綠豆漿混合發酵釀造復合豆漿酒，利用單因素試驗及響應面試驗對其發酵工藝進行優化，以期釀出風味獨特、酒體圓潤、諸味協調的復合豆漿酒，為工業化生產提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）滬釀2.069：宜賓職業技術學院菌種保藏中心；黃豆、綠豆、白砂糖：市售；冰乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：湖北鑫潤德化工有限公司；亞硫酸鈉（分析純）：南京試劑有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：無錫市亞泰聯合化工有限公司；次甲基藍（指示劑）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

JYL-C91T型豆漿機：九陽股份有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；FA20043型電子天平：上海越平科學儀器有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機：鄭州長城工貿有限公司；MC-GNP-9080系列隔水式恒溫培養箱：青島明成環保科技有限公司；DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌器：上海申安醫療器械廠；KL-30-10000型乳化均質機：上海科勞機械設備有限公司；BCD-2HBSA型電冰箱：青島海爾股分有限公司；PHs-3c型精密pH計：上海理達儀器廠；AT6000型酒精度測試儀：意大利蓋博分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 復合豆漿酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：挑選顆粒成熟飽滿的黃豆和綠豆，去除其中的雜質，清水洗凈后用5倍質量的清水浸泡9～12 h；將浸泡好的黃豆和綠豆分別加水磨漿過濾后，以黃豆漿為基準，添加一定比例的綠豆漿，并添加一定比例的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，利用檸檬酸鹽緩沖液調節pH為6.5，攪拌至白砂糖完全溶解，加熱至60℃，采用乳化均質機（壓力為15MPa）均質，均質后在95℃條件下加熱殺菌5min；待樣品冷卻后，在無菌條件下接入一定量的經活化后的酵母菌懸液，25℃條件下發酵，待發酵完成后置于4℃的冰箱中后熟24h。

1.3.2 理化指標測定方法[22]

總糖含量（以葡萄糖計）測定：斐林試劑法；酒精體積分數測定：密度瓶法；總酸含量測定：電位滴定法；氨基酸態氮含量測定：甲醛滴定法。

1.3.3 感官評價

邀請13位教師及實驗員組成評定小組，明確感官評定的指標和注意事項。參照符楨華等[13-14]對豆漿酒的研究方法及GB/T 23546—2009《奶酒》標準[22]從色澤、組織形態、香氣、滋味、典型性5個方面制定復合豆漿酒感官評價標準，滿分為100分，評價標準如表1所示。

表1 復合豆漿酒的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of compound soym ilk liquor

1.3.4 復合豆漿酒發酵工藝條件優化單因素試驗

以黃豆漿為基準，依次考察白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、綠豆漿添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、釀酒酵母接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及發酵時間（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）對復合豆漿酒感官評分的影響，以確定較佳的白砂糖添加量、綠豆漿添加量、釀酒酵母接種量、發酵時間。

1.3.5 復合豆漿酒發酵工藝條件優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選取白砂糖添加量（A）、綠豆漿添加量（B）、釀酒酵母接種量（C）、發酵時間（D）為考察因素，以感官評分（Y）為評價指標，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理[23]，進行4因素3水平的響應面分析試驗，確定復合豆漿酒最佳的發酵工藝條件，因素與水平見表2。

表2 復合豆漿酒發酵工藝條件優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optim ization of compound soym ilk liquor

1.3.6 數據分析處理方法

以上每個試驗重復3次，結果取平均值。采用OriginPro 10.1軟件進行數據制圖和統計分析。采用Design Expert 11.1.0.1軟件進行響應面設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 復合豆漿酒發酵工藝條件優化單因素試驗結果

2.1.1 白砂糖添加量對復合豆漿酒感官評分的影響

控制處理條件為綠豆漿添加量15%、釀酒酵母接種量0.3%、發酵時間6 d，考察白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）對復合豆漿酒感官評分的影響，結果見圖1。

圖1 白砂糖添加量對復合豆漿酒感官評分的影響Fig.1 Effect of sugar addition on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由圖1可知，當復合豆漿酒中白砂糖添加量從6%增至10%時，復合豆漿酒的感官評分也隨之增加；當添加量達到10%時，復合豆漿酒的感官評分達到最高分，為（83.3±0.7）分。但隨著白砂糖添加量的繼續增加，復合豆漿酒的感官評分開始呈現下降的趨勢。糖分在復合豆漿酒發酵過程中主要轉化為乙醇，也可以轉化成酸類、酯類、醛類等物質[8]，復合豆漿酒在發酵過程中，可發酵性糖過少會出現酒體不豐滿、香味不足的現象，可發酵性糖過多則會造成酒體酸度偏大等不良現象。故選用白砂糖添加量為8%、10%及12%用于后續響應面優化試驗。

2.1.2 綠豆漿添加量對復合豆漿酒感官評分的影響

控制處理條件為白砂糖添加量10%、釀酒酵母接種量0.3%、發酵時間6 d，考察綠豆漿添加量（5%、10%、15%、20%、25%）對復合豆漿酒感官評分的影響，結果見圖2。

圖2 綠豆漿添加量對復合豆漿酒感官評分的影響Fig.2 Effect ofmung bean m ilk addition on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由圖2可知，綠豆漿的添加能顯著改善豆漿酒的風味特征（P＜0.05），不僅能減弱豆漿酒中的豆腥味，而且能使其香氣更加豐滿。復合豆漿酒的感官評分隨著綠豆漿添加量的增加而呈現出先增高后降低的趨勢，當綠豆漿添加量為20%時，復合豆漿酒的感官評分達到最高，為（85.6±1.0）分。因綠豆溶出物含量較黃豆低[20，24]，故綠豆漿添加量過大會導致復合豆漿酒呈現風味不夠飽滿的現象。因此，當綠豆漿添加量適當時才能賦予復合豆漿酒特殊的風味及口感。由此選擇15%、20%、25%的綠豆漿添加量進行響應面優化試驗。

2.1.3 釀酒酵母接種量對復合豆漿酒感官評分的影響

控制處理條件為白砂糖添加量10%、綠豆漿添加量20%、發酵時間6 d，考察釀酒酵母接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對復合豆漿酒感官評分的影響，結果見圖3。

圖3 釀酒酵母接種量對復合豆漿酒感官評分的影響Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由圖3可知，當釀酒酵母接種量小于0.4%時，復合豆漿酒的感官評分隨著釀酒酵母接種量的不斷增加而增加。當釀酒酵母接種量為0.4%時，復合豆漿酒的感官評分達到最高，為（86.1±0.5）分。釀酒酵母在發酵過程中能將可發酵性糖轉化為二氧化碳和乙醇，同時還會產生一些醇、醛、酸、酯等香味物質[1，12]。當釀酒酵母接種量較低時，容易使釀酒原料不完全發酵，造成復合豆漿酒的酒精度偏低、酒香不突出等現象。當釀酒酵母的接種量為0.3%～0.5%時，復合豆漿酒的感官評分雖有變化，但相互之間并無顯著性差異（P＞0.05），表明釀酒酵母接種量從0.3%繼續增加后對復合豆漿酒的感官特性并無顯著性影響。所以選擇釀酒酵母接種量為0.2%、0.3%、0.4%進行響應面優化試驗。

2.1.4 發酵時間對復合豆漿酒感官評分的影響

控制處理條件為白砂糖添加量10%、綠豆漿添加量20%、釀酒酵母接種量0.3%，考察發酵時間（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）對復合豆漿酒感官評分的影響結果見圖4。

圖4 發酵時間對復合豆漿酒感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由圖4可知，當復合豆漿酒的發酵時間為7 d時，復合豆漿酒的感官評分最高，為（87.9±0.7）分。當發酵時間少于7 d時，因發酵醪液中可發酵性糖類還未完全被釀酒酵母所利用，酒體略顯寡淡，香味濃郁程度不高。當發酵時間超過7 d后，復合豆漿酒的酸度開始增大，破壞了酒體的風味。其原因可能是當發酵時間過長時，酒精抑制了釀酒酵母的生長，出現了菌體自溶現象，同時一部分乙醇被轉化為有機酸，導致酒體酸度增加[25]。因此，選擇發酵時間為6～8 d進行響應面優化試驗。

2.2 復合豆漿酒發酵工藝條件優化響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以復合豆漿酒的感官評分（Y）為響應指標，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，通過Design Expert11.1.0.1軟件設計響應面法試驗，考察白砂糖添加量（A）、綠豆漿添加量（B）、釀酒酵母接種量（C）、發酵時間（D）4個因素對復合豆漿酒感官評分的影響，響應面試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

經Design Expert軟件對表3的數據進行多元回歸擬合，得到復合豆漿酒感官評分的回歸方程：

表3 復合豆漿酒發酵工藝條件優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optim ization of compound soym ilk liquor

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

續表

由表4可知，由Box-Benhnken中心組合試驗設計原理所得的回歸模型極為顯著（P＜0.01），且失擬項檢驗不顯著（P＞0.05），表明未知因素對試驗結果的干擾較小，該試驗模型能充分擬合試驗數據，并可以用于確定復合豆漿酒釀造的最佳工藝[26-27]。4個因素對復合豆漿酒感官評分影響的主次順序依次為D＞A＞C＞B，即發酵時間＞白砂糖添加量＞釀酒酵母接種量＞綠豆漿添加量，其中一次項A、D和交互項CD對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項AB對結果影響顯著（P＜0.05）；二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），D2對結果影響顯著（P＜0.05）；其他項則對結果影響不顯著（P＞0.05）。根據復合豆漿酒感官評分回歸方程得出不同因子的響應面分析圖，結果見圖5。

圖5 各因素交互作用對復合豆漿酒感官評分的響應面曲線及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

響應面圖曲面坡度越陡峭及對應的等高線越密集呈橢圓形表示兩因素交互影響越大[27-30]。由圖5可知，因素C與因素D之間所形成的響應面曲面坡度在兩因素交互作用響應面圖中最為陡峭，等高線也最為密集，即因素C與因素D之間具有最強的交互作用；因素A與因素B之間所形成的響應面曲面坡度陡峭程度較CD次之。該結果與表4方差分析所得的釀酒酵母接種量與發酵時間之間具有極顯著的交互作用（P＜0.01）、白砂糖添加量與綠豆漿添加量之間具有顯著的交互作用（P＜0.05）的結論相吻合。

通過Design Expert軟件分析確定復合豆漿酒的最佳發酵工藝條件為白砂糖添加量10.82%、綠豆漿添加量19.06%、釀酒酵母接種量0.27%及發酵時間6.22 d，在此優化條件下，復合豆漿酒感官評分的理論值為91.17分。為便于實際操作，將復合豆漿酒的最佳發酵工藝條件修訂為白砂糖添加量10.8%、綠豆漿添加量19%、接種量0.27%及發酵時間6.2 d，在此最優發酵工藝條件下，進行3次平行驗證，得到復合豆漿酒的感官評分為（91.4±0.8）分，與其理論值基本一致。

2.3 理化指標分析

在最佳發酵工藝條件下得到的復合豆漿酒其總糖含量為12.1g/L、酒精度為4.3%vol、總酸含量為7.2g/L、氨基酸態氮含量為0.24 g/L。以上4種理化指標均符合國標GB/T 23546—2009《奶酒》[22]的標準。

3 結論

在單因素試驗的基礎上采用響應面法對復合豆漿酒的發酵工藝條件進行了優化，確定其最優發酵工藝條件：在黃豆漿中添加19.1%的綠豆漿、10.8%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，利用檸檬酸鹽緩沖液調節pH為6.5，攪拌至白砂糖完全溶解，加熱至60℃，采用乳化均質機（壓力為15MPa）均質，均質后在95℃條件下加熱殺菌5min；待樣品冷卻后，在無菌條件下接入0.27%經活化后的釀酒酵母菌懸液，25℃條件下發酵6.2 d后置于4℃的冰箱中后熟24 h。此條件下可獲得色澤微黃透明、豆香與酒香和諧、酒體豐滿圓潤的復合豆漿酒，其感官評分為91.4分。