基于高通量測(cè)序不同生產(chǎn)工藝晴隆酸菜細(xì)菌多樣性分析

郭倩倩，盧 彪*

（興義民族師范學(xué)院 生物與化學(xué)學(xué)院，貴州 興義 562400）

傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜多是指將不同的蔬菜利用環(huán)境中的微生物及各種配料進(jìn)行發(fā)酵處理，使之具有不同風(fēng)味，并增強(qiáng)了保藏性的蔬菜制品，如四川泡菜[1]、榨菜[2]、東北酸菜[3]、發(fā)酵芥菜[4]、剁辣椒[5]等。晴隆酸菜是貴州省黔西南州的特色發(fā)酵蔬菜之一，主要以芥菜葉為原料，經(jīng)自然發(fā)酵而成。其具有酸爽可口、回味悠長(zhǎng)、柔韌適中等特點(diǎn)，深受食客的喜愛。目前，晴隆酸菜的生產(chǎn)工藝以工廠化生產(chǎn)及家庭作坊式生產(chǎn)兩種方式為主，工廠化生產(chǎn)工藝與家庭作坊生產(chǎn)工藝的最主要區(qū)別是工廠化生產(chǎn)在腌制（發(fā)酵）初期進(jìn)行了老酸湯或者菌劑的添加；而家庭作坊式生產(chǎn)僅依靠環(huán)境微生物進(jìn)行自然發(fā)酵。

目前，關(guān)于酸菜中微生物群落的研究主要集中在乳酸菌多樣性的分析，有文獻(xiàn)報(bào)道[6-10]，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為酸菜的優(yōu)勢(shì)菌屬。而關(guān)于晴隆酸菜中細(xì)菌多樣性的研究尚少見報(bào)道。高通量測(cè)序技術(shù)廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性分析[11-13]。關(guān)統(tǒng)偉等[14]通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)郫縣豆瓣全發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、豐度及演替規(guī)律進(jìn)行了研究；劉大群等[15]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同鹽量榨菜坯料中細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了分析。

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析工廠化和家庭作坊式兩種不同工藝生產(chǎn)的晴隆酸菜中細(xì)菌的多樣性，采用熱圖分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)不同晴隆酸菜酸菜樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性進(jìn)行分析，最后對(duì)其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬進(jìn)行分析，為晴隆酸菜風(fēng)味研究以及安全性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

晴隆酸菜：市售。包括工廠化生產(chǎn)酸菜樣品分別編號(hào)為F1、F2，標(biāo)記為A組；家庭作坊生產(chǎn)酸菜樣品分別編號(hào)為S1、S2、S3，標(biāo)記為B組。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.R Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：美國(guó)OMEGA公司；Qubit3.0DNA檢測(cè)試劑盒：美國(guó)Life公司；Taq DNA聚合酶（1 000U）：中國(guó)Vazyme公司；AgencourtAMPure XP：美國(guó)Beckman公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)ThermoFisher公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；T100TMThermal Cyeler/1861096聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 總DNA提取與檢測(cè)

使用E.Z.N.A.R SoilDNA試劑盒提取晴隆酸菜樣品的總DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

利用Qubit3.0DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)總DNA精確定量后，以其為模板進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。第一輪PCR擴(kuò)增所用引物為V3-V4區(qū)通用引物（341 Primer F：5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3'；805 Primer R：5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'）[16]。第二輪PCR擴(kuò)增所用引物為引入Illumina橋式PCR兼容引物（Primer F：5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG-3；Primer R：5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。第一輪PCR擴(kuò)增體系：2×Taq masterM ix15μL，341PrimerF（10μmol/L）1μL，805PrimerR（10μmol/L）1μL，基因組DNA 10～20ng，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至30μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃、3min；94 ℃、3m in，45 ℃、20 s，65 ℃、30 s，共5個(gè)循環(huán)；94 ℃、20 s，55℃、20s，72℃、30s，共20個(gè)循環(huán)；72℃、5min。以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系同第一輪，PCR擴(kuò)增條件：95℃、3m in；94℃、20s，55℃、20s，72℃、30 s，共5個(gè)循環(huán)；72℃、5min。采用AgencourtAMPureXP對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、回收。

1.3.3 測(cè)序

回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)為Illum inaM ieq，測(cè)序讀長(zhǎng)為雙向300bp。

1.3.4 分析方法

高通量測(cè)序所得序列通過拼接、過濾、去除嵌合體，得到最終有效序列。利用QIIME劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT），將相似度＞97%的序列定義為一個(gè)OTU，每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于一種代表序列。基于16SRNA基因數(shù)據(jù)庫（RDP數(shù)據(jù)庫、Silva數(shù)據(jù)庫、NCBINT數(shù)據(jù)庫）進(jìn)行16S rRNA基因序列比對(duì)、分類學(xué)注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于操作分類單元細(xì)菌Alpha多樣性分析

通過拼接、過濾、去除嵌合體，得到最終有效序列。利用QIIME劃分OUT，將相似度＞97%的序列定義為一個(gè)OUT，并基于OTU對(duì)5種晴隆酸菜中細(xì)菌的Alpha多樣性（Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)）進(jìn)行分析[17]，具體結(jié)果見表1。

表1 晴隆酸菜中細(xì)菌Alpha多樣性分析結(jié)果Table 1 Analysis and results of bacterial Alpha diversity in Qinglong sauerkraut

由表1可知，通過高通量測(cè)序，從5種晴隆酸菜樣本中共獲得136 943條有效序列，3 214個(gè)OUT。所有樣品的Coverage指數(shù)均＞0.9，說明樣品文庫中序列的覆蓋率高，可反應(yīng)樣品測(cè)序的真實(shí)情況。A組Shannon指數(shù)均低于B組，而Simpson指數(shù)均高于B組，說明家庭作坊生產(chǎn)酸菜細(xì)菌群落多樣性普遍高于工廠化生產(chǎn)酸菜。A組Chao1指數(shù)較為相近，而B組Chao1指數(shù)相差較大，分析原因可能與B組中不同家庭作坊的生產(chǎn)環(huán)境變化較大有關(guān)。

2.2 基于門與屬水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

通過高通量測(cè)序分析，從5種晴隆酸菜樣品中共鑒定出細(xì)菌門19個(gè)，細(xì)菌屬416個(gè)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，樣品F1中鑒定出8個(gè)門91個(gè)屬，樣品F2中鑒定出9個(gè)門121個(gè)屬，樣品S1中鑒定出18個(gè)門240個(gè)屬，樣品S2中鑒定出8個(gè)門167個(gè)屬，樣品S3中鑒定出15個(gè)門269個(gè)屬，且A組（F1、F2）細(xì)菌的門與屬明顯低于B組（S1、S2、S3），說明工廠化生產(chǎn)晴隆酸菜中細(xì)菌種類在門水平及屬水平上均明顯低于家庭作坊生產(chǎn)晴隆酸菜中的細(xì)菌種類。

圖1 樣品中細(xì)菌的門與屬數(shù)目Fig.1 Phyla and genera num bers of bacteria in allsamples

韋恩圖可以直觀的體現(xiàn)樣品中細(xì)菌組成的相似性和重疊情況，因此，對(duì)兩組樣品的細(xì)菌門、屬數(shù)目進(jìn)行韋恩圖分析，結(jié)果如圖2、圖3所示。由圖2可知，工廠化生產(chǎn)晴隆酸菜樣品F1、F2共有細(xì)菌門為7個(gè)；家庭作坊式生產(chǎn)晴隆酸菜樣品S1、S2、S3共有細(xì)菌門為7個(gè)。由圖3可知，樣品組內(nèi)存在共有細(xì)菌屬，其中樣品F1、F2共有細(xì)菌屬53個(gè)；樣品S1、S2、S3共有細(xì)菌屬96個(gè)。

圖2 工廠化（A）及家庭作坊式（B）生產(chǎn)酸菜細(xì)菌門數(shù)目韋恩圖Fig.2 Venn diagram of bacteria phyla numbers in sauerkraut produced by factory(A)and fam ily workshops(B)

圖3 工廠化（A）及家庭作坊式（B）生產(chǎn)酸菜細(xì)菌屬數(shù)目韋恩圖Fig.3 Venn diagram of bacteria genera numbers in sauerkraut produced by factory(A)and fam ily workshops(B)

2.3 基于屬水平、OTU水平晴隆酸菜樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性分析

對(duì)5種晴隆酸菜樣品中細(xì)菌相對(duì)豐度前20的細(xì)菌屬進(jìn)行熱圖-聚類分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，樣品F1和F2各屬顏色深淺較為接近且為同一聚類，說明工廠化生產(chǎn)的晴隆酸菜細(xì)菌群落中各屬組成較為接近。而樣品S1、S2和S3各屬顏色深淺差距較大且不在同一聚類，說明家庭作坊生產(chǎn)的晴隆酸菜細(xì)菌群落組成差異較大。

基于OTU水平，采用PCA對(duì)5種晴隆酸菜樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，PC1、PC2、PC3分別解釋了樣品中細(xì)菌OUT的58%、23%、11%的信息，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99%?；谶@3個(gè)主成分，樣品F1和F2距離較近，說明F1和F2樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，即兩種工廠化生產(chǎn)酸菜的細(xì)菌群落構(gòu)成較為相似。A組（F1、F2）和B組（S1、S2、S3）存在一定距離，說明兩組樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性有一定差異，即工廠化生產(chǎn)晴隆酸菜的細(xì)菌群落構(gòu)成與家庭作坊生產(chǎn)晴隆酸菜區(qū)別較大。細(xì)菌群落的PCA結(jié)果與細(xì)菌相對(duì)豐度熱圖分析結(jié)果較為一致。

圖4 5種晴隆酸菜樣品細(xì)菌相對(duì)豐度熱圖Fig.4 Heatmap of bacterial relative abundance of 5 Qinglong sauerkraut samples

圖5 5種晴隆酸菜樣品中細(xì)菌群落主成分分析Fig.5 Principal component analysis of bacterial community in 5 Qinglong sauerkraut samples

2.4 基于屬水平優(yōu)勢(shì)菌株的分析

在屬水平上對(duì)兩種類型晴隆酸菜中的細(xì)菌進(jìn)行分類，統(tǒng)計(jì)它們的相對(duì)豐度。根據(jù)相對(duì)豐度≥5.0%確定為晴隆酸菜中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，結(jié)果如表2所示。

表2 5種晴隆酸菜樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌及相對(duì)豐度Table 2 Dom inantbacteria and relative abundance of 5 Qinglong sauerkraut samples

由表2可知，在兩種工廠化生產(chǎn)的晴隆酸菜中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的種類相同，分別為乳酸球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、大洋桿菌屬（Oceanobacillus）。但不同細(xì)菌屬的相對(duì)豐度不同，其中樣品F1中Lactococcus相對(duì)豐度最高，為26.33%，而樣品F2中Lactobacillus相對(duì)豐度最高，為47.94%，均為常見乳酸菌屬。在工廠化生產(chǎn)的晴隆酸菜中的4種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中，Lactococcus[18-20]、Bacillus[21-22]、Lactobacillus[23-24]均屬于發(fā)酵食品常見菌，而Oceanobacillus在食品研究中較少[25]。

3種家庭作坊生產(chǎn)的晴隆酸菜樣品中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬各有差異，但均含有Lactobacillus，相對(duì)豐度分別為5.76%、8.03%、5.16%。在家庭作坊生產(chǎn)的晴隆酸菜優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中，弧菌屬（Vibrio）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium）中存在致病微生物。因此，對(duì)于可直接食用的酸菜來說，仍存在較大的食品安全隱患。

3 結(jié)論

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)兩種不同工藝生產(chǎn)的晴隆酸菜樣品中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，細(xì)菌多樣性方面，5個(gè)酸菜樣品中共鑒定出19門，416屬。樣品F1中8門91屬，F(xiàn)2中9門121屬，共有門為7個(gè)，共有屬為53個(gè)；樣品S1中18門240屬，S2中8門167屬，S3中15門269屬，共有門為7個(gè)，共有屬為96個(gè)；家庭作坊生產(chǎn)的酸菜的細(xì)菌多樣性較工廠化生產(chǎn)的酸菜高；工廠化生產(chǎn)的酸菜細(xì)菌群落組成較相近。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬方面，工廠化生產(chǎn)的酸菜優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相同，均為乳酸球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、大洋桿菌屬（Oceanobacillus）。而家庭作坊生產(chǎn)的酸菜優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬各有差異，但均含有Lactobacillus，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中的弧菌屬（Vibrio）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium）中存在致病微生物。