野生獼猴桃酒蘋果酸-乳酸發酵優良乳酸菌的篩選與耐受性研究

李建芳，周 楓*，王 爽，王榮榮，朱 靜

（1.信陽農林學院 食品學院，河南 信陽 464000；2.中國海洋大學 食品學院，山東 青島 266000）

我國作為獼猴桃的原產國，野生資源豐富，擁有62個種，已有2 000多年的文字記載歷史[1]。野生獼猴桃具有較高的營養價值和功能作用，是釀造果酒的優質資源，但因其含有較高的有機酸，造成酒體粗糙，酸味過重，通常還會伴隨著酒體失光、渾濁等不良現象[2]。

蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）是乳酸菌以L-蘋果酸為底物，在蘋果酸乳酸酶（malolactic enzyme，MLE）的催化作用下，轉變成L-乳酸和CO2的過程[3-4]。其被認為是一個二次發酵過程，在大多數果酒的生產中發揮著不可或缺的作用。MLF可適當地降低酒體中的有機酸含量[5-6]，改善葡萄酒的穩定性[7]，降低果酒中某些有害成分[8]，是提高果酒柔和度和穩定性的重要工序，已在葡萄酒或蘋果酒中廣泛應用。

在傳統的果酒發酵過程中，MLF是在酒精發酵剛剛完成之后進行的，可以是自然發酵，也可以是接種發酵劑發酵。然而，在復雜的酒體中，并非所有的細菌都容易生長，如低pH值（＜3.5）、高SO2（＞50mg/L）、高酒精度（＞4%vol）以及中鏈脂肪酸、酚類化合物（如酚酸、單寧）和酵母發酵副產物抑制蛋白質等均可以抑制乳酸菌的生長[9]。因此，篩選蘋果酸-乳酸發酵的優良菌株，最基本的要求是具有良好的適應性和釀酒特性，并具有較強的蘋果酸降解能力。目前，國內外獼猴桃酒優良MLF乳酸菌相關研究較少。以果酒為原料分離篩選優良MLF乳酸菌是MLF乳酸菌選育的主要手段之一[10]。

因此，本研究通過形態觀察、生理生化試驗從自然發酵的野生獼猴桃酒中分離篩選出能夠進行MLF的乳酸菌，以商業用菌為對照菌株，對分離菌株的SO2、酒精、pH耐受能力進行研究，從而獲得綜合耐受能力較強的優良菌株。旨在為獼猴桃酒的工業生產提供MLF高耐受性優良菌株，同時為提高獼猴桃酒的質量和穩定性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

野生獼猴桃果實：于2017年9月采摘自豫南大別山區，成熟度為八成。

1.1.2 菌株

果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；商業乳酸菌（SY）（Leuconostoconos.b.V.D）：法國LALLEMANDS.A.公司。

1.1.3 化學試劑

過氧化氫、D-L蘋果酸、乳酸、溴酚藍、體積分數50%冰乙酸、正丁醇：國藥集團化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.1.4 培養基

改良MRS培養基、改良番茄汁瓊脂（tomato juice agar，TJA）培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；酸性番茄（acid tomato juice，ATB）培養基：招遠拓普生物工程有限公司；糖發酵培養基：杭州微生物試劑有限公司；石蕊牛奶培養基：北青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

JC303型生化培養箱：南通嘉程儀器有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：杭州博大凈化設備有限公司；JC101型電熱鼓風干燥箱：西安安森智能儀器股份有限公司；WYT-J型手持糖度計：上海滬粵明科學儀器有限公司；LDZX-50FA型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；TP310型pH計：北京時代新維測控設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃酒的發酵

選取新鮮、成熟的獼猴桃果實，破碎，打漿后加入0.2g/L活化果酒專用酵母啟動酒精發酵。調節總SO2質量濃度為60mg/L，分裝至2 L發酵罐中，在25℃條件下進行酒精發酵，待酒精發酵結束后去渣倒罐，利用獼猴桃酒體中的乳酸菌自然啟動MLF。

1.3.2 蘋果酸-乳酸發酵的監測

以1.5%乳酸標準液為對照，采用紙層析法[11]測定乳酸含量，進而對蘋果酸-乳酸發酵進行監測。

1.3.3 蘋果酸-乳酸發酵乳酸菌的分離

參照何志剛等[12]的方法，略作改動。在無菌條件下，取自然啟動MLF的酒樣，適當稀釋后，吸取0.1m L酒樣均勻涂布于ATB培養基，在28℃條件下培養5～6 d，挑取圓形且稍扁平的單菌落在MRS培養基上進行分離純化，獲得純菌株進行編號。

1.3.4 形態觀察

參照周安玲[13]的方法，略作改動。將適當稀釋度的分離菌懸液分別涂布于TJA培養基，于25℃條件下恒溫培養2～3 d，逐一觀察菌落的形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、顏色等特點，并分別進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察細胞形態。

1.3.5 生理生化試驗

對分離菌株進行乳糖發酵試驗、觸酶試驗和石蕊牛奶試驗，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[14]、《葡萄酒釀造微生物學-實驗技術與規程》[15]及《乳酸細菌基礎、技術和應用》[16]對試驗結果進行分析，篩選出具有MLF能力的乳酸菌。

1.3.6 耐受性試驗

一般情況下，乳酸菌代謝糖類的適宜溫度為22～25℃，且MLF速度較快，揮發酸較多；在15～20℃條件下，MLF速度稍慢，酒體成分也會發生相應變化；10℃以下，乳酸菌的生長會受到抑制。因此，本試驗選擇在25℃條件下，參照段浩云等[17]的方法（略作改動）研究篩選菌株的耐受性。具體方法：挑取適量保存于TJA斜面的菌株分別接種于10mLATB液體培養基中，25℃條件下活化24～48h。取1m L種子液（107CFU/m L）分別接種于9m L不同SO2質量濃度（40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L）、酒精度（8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol）、pH值（2.8、3.0、3.2、3.4、3.6）的MRS液體培養基中，25 ℃條件下靜置培養2 d，在顯微鏡下用血細胞計數板對活菌進行計數，篩選出綜合耐受性能較好的乳酸菌。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離篩選

對自然啟動MLF的野生獼猴桃酒樣中的乳酸菌進行分離、純化，得到6株疑似乳酸菌，均呈革蘭氏陽性，分別編號為R6、R7、R11、R14、R15、R18，6株疑似乳酸菌的菌落形態及細胞形態詳細描述見表1。

表1 分離菌株的菌落和細胞形態結果Table 1 Colonialand cellmorphology of isolated strains

由表1可知，分離得到的6株疑似乳酸菌菌落較小，菌落直徑在0.8～1.8mm，圓形，白色、乳白色或灰白色，均不透明。其中菌株R6、R11、R15、R18菌落表面光滑、濕潤；菌株R7和R14菌落表面半濕潤；菌株R14菌落表面不光滑；菌株R6、R15、R18菌落中央凸起，菌株R7、R11、R14菌落中央平整。菌株R14和R18細胞呈球形，成鏈排列；其他菌株細胞形態為短桿狀或長桿狀，單個或成對或鏈狀排列。

對6株分離菌株分別進行乳糖發酵試驗、觸酶試驗、石蕊牛奶試驗，結果表明，6株分離菌株觸酶試驗均為陰性，牛奶石蕊試驗和乳糖發酵試驗均為陽性。結合菌落形態和細胞形態初步鑒定6株菌均為乳酸菌。

2.2 分離菌株耐受性研究

2.2.1 SO2耐受能力

SO2是果酒釀造中廣為使用的添加劑，其主要作用是防止酒體褐變和避免雜菌的污染。但是乳酸菌的生長對SO2較為敏感，在已報道的菌株中，大多菌株的SO2耐受能力＜60mg/L[18]，為防止酒體氧化褐變和雜菌大量繁殖而導致揮發酸含量升高，尋找具有耐受高SO2能力的乳酸菌株成為MLF進程中的關鍵。因此，以商業乳酸菌SY為對照，對分離得到的6株乳酸菌的SO2耐受性進行測定，結果見表2。

表2 分離菌株的SO2耐受性Table 2 SO2 tolerance of isolated strains

由表2可知，當SO2含量為40mg/L時，所有菌株活菌數＞107CFU/m L，最高可達108CFU/m L；當SO2含量為60mg/L時，除菌株R18外，其他菌株均表現出較強的SO2耐受能力，活菌數均＞106CFU/m L；當SO2含量為80mg/L時，菌株R6、R7、R15表現出較強的SO2耐受能力，活菌數均＞106CFU/m L；當SO2含量為100mg/L時，菌株R6、R11、R15、R18均呈現負增長趨勢，且處于不生長狀態，菌株R7仍表現出較好的耐受能力，菌株R14未出現負增長，但處于不生長狀態；當SO2含量為120mg/L時，6株分離菌均呈現負增長趨勢，且處于不生長狀態。從桿菌與球菌之間來看，整體上桿菌對SO2的耐受能力高于球菌。以SO2質量濃度為80mg/L時，商業乳酸菌SY的增殖量為標準，可篩選確定SO2耐受能力較強的菌株為R6、R7和R15，其中，菌株R7的SO2耐受能力最強。

2.2.2 酒精耐受能力

在獼猴桃酒發酵過程中，酵母菌代謝的主要產物是乙醇，隨著發酵的進行，獼猴桃酒中酒精度越來越高，一般可達10%vol～14%vol。酒精度是抑制乳酸菌生長的重要因素，過高的酒精度可影響乳酸菌的新陳代謝活動，抑制其生長。因此，以商業乳酸菌SY為對照，對分離得到的6株乳酸菌的酒精耐受性進行測定，結果見表3。

由表3可知，酒精度對分離乳酸菌的生長均表現出一定程度的抑制作用，隨著培養基中酒精度由8%vol逐漸增大，對乳酸菌的抑制作用逐漸增強，兩者呈顯著正相關（P＜0.05）。當酒精度為8%vol時，6株菌株的活菌數均＞107CFU/mL，生長狀況良好；當酒精度為10%vol時，菌株R11、R15、R18的活菌數下降一個級別，而菌株R6、R7的活菌數依然為108CFU/m L；當酒精度增至12%vol時，所有分離菌株的活菌數均下降一個級別，其中菌株R18降至105CFU/m L以下或不生長；當酒精度為14%vol時，6株分離菌株酒精耐受能力繼續下降，大部分菌株不生長，而篩選菌株R6和R7的活菌數仍為106CFU/m L，表現出較強的酒精度耐受力，但均低于商業乳酸菌SY；當酒精度增至16%vol時，分離菌的活菌數均降至105CFU/m L以下或不生長。參照菌株SY在酒精度12%vol的活菌數，確定酒精度耐受性較強的菌株為R7，整體上桿菌對酒精的耐受能力高于球菌。

2.2.3 pH值耐受能力

不同乳酸菌對pH值的適應能力不同，大部分的乳酸菌最適生長pH接近中性[19]，也有一些種屬如酒球菌屬（Oenococcus）和乳桿菌（Lactobacillus）是嗜酸的[20]。獼猴桃酒體的pH值一般在2.8～3.6范圍內變化，因此，以商業乳酸菌SY為對照，對分離得到的6株乳酸菌的pH值耐受性進行測定，結果見表4。

由表4可知，pH值對分離乳酸菌的生長均表現出一定程度的抑制作用，隨著培養基中pH由3.6逐漸降低，對乳酸菌的抑制作用逐漸增強，兩者呈顯著負相關（P＜0.05）。當pH值為3.6時，6株乳酸菌活菌數均＞107CFU/m L，總體生長較好，其中菌株R6、R15和R18的活菌數達到108CFU/m L；當pH值下降到3.4時，除菌株R11、R18外，其他菌株活菌數均下降一個級別，活菌數開始顯著下降；當pH值下降到3.2時，活菌數繼續顯著下降，其中，菌株R14下降到105CFU/m L以下或不生長；當pH值下降到3.0時，活菌數繼續顯著下降，但菌株R15仍表現出較好的pH值耐受能力；當pH值下降到2.8時，分離菌株及商業乳酸菌SY的活菌數均不增長。整體上桿菌對pH的耐受能力高于球菌。參照商業乳酸菌SY，菌株R15的pH耐受性較好。

表4 分離菌株的pH值耐受性Table 4 pH tolerance of isolated strains

綜上，可以初步認為在從自然啟動MLF的野生獼猴桃酒中分離得到的6株乳酸菌中，菌株R6、R7和R15的SO2、酒精及pH耐受性較好，可以作為獼猴桃酒的生物降酸優良菌株，對果酒生物降酸技術的提升及果酒質量的提高有著重要意義。

3 結論

采用ATB培養基，通過形態觀察及生理生化試驗從自然啟動MLF野生獼猴桃酒中初篩得到6株乳酸菌，分別為R6、R7、R11、R14、R15、R18。通過對6株乳酸菌的SO2、酒精及pH耐受性的研究發現，分離菌株中乳酸桿菌的耐受能力高于球菌。其中，3株乳酸菌（R6、R7、R15）具有較強的SO2、酒精及pH耐受能力，菌株R6、R15在SO280mg/L及菌株R7在SO2100mg/L可維持生長；菌株R6、R7在酒精度14%vol及菌株R15在酒精度12%vol可維持生長；菌株R6、R7在pH值3.2及菌株R15在pH 3.0時可維持生長。結果表明，菌株R6、R7、R15可以作為MLF優良乳酸菌進一步開發與應用的研究對象。