宮頸癌組織中HPV16、18E6與p53的表達水平及臨床意義

陳 宓

宮頸癌是1種高發于發展中國家女性生殖系統的惡性腫瘤，每年的發病率及死亡率居高不下[1]。宮頸癌發病機制復雜，癌基因、早婚早育、性生活混亂、不良生活習慣及病毒感染等多種因素共同參與其中[2-3]。但根據數據調查顯示，絕大多數宮頸癌患者均有高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染史，HPV已被證實是宮頸癌癌前病變及發病的獨立影響因素[4]。作為HPV中最常見的類型，HPV16和HPV18型病毒主要通過抑制抑癌基因的功能，促使細胞癌變[5]。本研究對宮頸癌組織中的人乳頭瘤病毒16、18型E6蛋白(human papillomavirus type16、18 E6，HPV16、18E6)與p53的表達水平進行檢測，并分析其臨床意義，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2012年4月至2017年7月收治的宮頸癌患者131例，年齡29～61歲，分別收集其手術切除的宮頸癌組織及癌旁正常組織作為研究組和對照組。根據TNM臨床分期標準對131例患者進行分期，其中Ⅰ期78例，Ⅱ期43例，Ⅲ期10例。納入標準：①術后經組織病理學檢測確診為宮頸癌；②術前未接受放療、化療、靶向治療及其他腫瘤系統性治療；③有HPV16和HPV18型病毒感染史。排除標準：①合并其他系統惡性腫瘤；②住院資料不完整；③依從性不好，不能配合研究。本研究上報本院醫學倫理委員會批準，所有患者對本研究中樣本收集充分知情并理解，均自愿簽署知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

中性甲醛(上海鈺博生物科技有限公司)；PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)；EDTA抗原修復液(青島捷世康生物科技有限公司)；兔抗人HPV16、18E6單克隆抗體、鼠抗人p53多克隆抗體(上海篤瑪生物科技有限公司)；羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(上海研謹生物科技有限公司)；辣根酶標記鏈霉卵白素(上海赫澎生物科技有限公司)；DAB顯色盒(南京賽泓瑞生物科技有限公司)；蘇木素(上海寶曼生物科技有限公司)；生物組織包埋機(型號：SDSCV9000，意大利Diapath公司)；組織切片機(型號：OST 5000，美國Warner公司)；電熱恒溫水箱(蘇州凱特爾儀器設備有限公司)。

1.3 方法

采用免疫組織化學染色法檢測宮頸癌及癌旁正常組織中HPV16、18E6與p53蛋白的表達水平。所有組織在離體1 h內用中性甲醛固定，依次經脫水、透明、石蠟包埋后用組織切片機切成連續切片，厚度約為4 μm，接著對組織切片進行脫蠟、漂片烘干、抗原修復、過氧化物酶阻斷，山羊血清封閉后，滴加一抗兔抗人HPV16、18E6單克隆抗體和鼠抗人p53多克隆抗體，2種抗體工作濃度均為1∶100，4 ℃孵育過夜，經PBS緩沖液3次清洗，滴加二抗羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG，37 ℃孵育15 min，用PBS緩沖液清洗3次，加入適量經PBS緩沖液稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素，37 ℃孵育10 min，PBS緩沖液清洗后，嚴格按照DAB顯色盒說明書對切片進行顯色操作，清洗后用蘇木精復染，再清洗、脫水、制片，采用光學顯微鏡進行閱片。

免疫組化結果判斷：2名具有執業資格經驗豐富的病理科醫生在雙盲情況下進行閱片，避開組織壞死出血及刀口區，隨機選取5個高倍視野，每個視野包含100個細胞，觀察染色程度，統計每個視野陽性細胞率并求平均值。將不著色、黃色、棕黃色、黃褐色分別記為0、1、2、3分；將陽性細胞率≤10%、>10%～20%、>20%～50%、>50%～80%、>80%分別記為0、1、2、3、4分。將兩項評分相乘計算免疫組化評分(immunohistochemical scores，IHS)，當IHS≤2分時，記為(-)，當IHS≥3分時，記為(+)。

1.4 觀察指標

宮頸癌組織及癌旁正常組織中HPV16、18E6與p53的表達水平，宮頸癌組織中p53的表達水平與HPV16、18E6的關系，以及宮頸癌患者年齡、TNM分期、組織學分級、淋巴結轉移情況及病理類型等病理臨床特征與HPV16、18E6和p53的表達水平間的關系。

1.5 統計學處理

本研究所有數據采用SPSS20.0數據統計軟件進行分析，采用卡方檢驗對計數資料進行分析，p53表達水平與HPV16、18E6的關系采用Spearman等級相關進行分析。P<0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織及癌旁正常組織中HPV16、18E6和p53的表達情況

HPV16、18E6主要表達于細胞核，少部分表達于細胞質，p53表達于細胞核，免疫組化陽性染色均為棕黃色。HPV16、18E6在宮頸癌組織及癌旁正常組織中的陽性表達率分別為74.8%(98/131)和39.7%(52/131)，p53在宮頸癌組織及癌旁正常組織中的陽性表達率分別為22.1%(29/131)和1.5%(2/131)，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 宮頸癌組織及癌旁正常組織中HPV16、18E6和p53的表達情況比較(例，%)

2.2 宮頸癌組織中p53的表達水平與HPV16、18E6的關系

比較HPV16、18E6表達水平不同的宮頸癌組織中p53的表達，HPV16、18E6陽性的宮頸癌組織中p53的陰性表達率為76.5%(75/98)，宮頸癌組織中p53的表達水平與HPV16、18E6呈負相關(γ=-0.58，P<0.05)。見表2。

表2 宮頸癌組織中p53與HPV16、18E6的關系/例

2.3 HPV16、18E6及p53與宮頸癌臨床病理特征的關系

分析131例宮頸癌組織中HPV16、18E6的表達水平發現，HPV16、18E6與患者年齡、組織學分級和病理分型有關(P<0.05)，與TNM分期和淋巴結轉移情況無關(P>0.05)；p53表達與患者TNM分期和組織學分級有關(P<0.05)，與年齡、淋巴結轉移和病理分型情況無關(P>0.05)。見表3。

表3 HPV16、18E6及p53與各病理臨床特征的關系/例

3 討論

宮頸癌的發生是多個致病因素共同作用的結果，作為最有公認度的宮頸癌高危因素，高危型HPV的持續感染可加速宮頸癌前病變到癌變的過程[6]。流行病學調查結果顯示，僅有1%～10%的宮頸癌患者無HPV感染史[7]。HPV有多種類型，在宮頸癌患者中最為常見的有HPV16型及HPV18型，分別促進宮頸鱗癌及宮頸腺癌的發生[8-9]。作為一種惡性腫瘤，宮頸癌各臨床病理特征與治療方案的選擇及疾病預后都密切相關，因此尋找與各臨床病理特征有關的指標，對宮頸癌患者意義重大。

HPV16、18主要通過早期癌蛋白E6發揮其致癌作用，其作用機制為HPV16、18E6與p53結合，使p53功能化結構發生改變，喪失生理作用，并促使其進入泛素依賴的降解過程[10-11]。生理情況下，細胞內p53蛋白表達處于低水平，而當機體受到不良刺激，DNA發生損傷時，p53蛋白水平明顯上升，起到修復損傷DNA、誘導DNA發生損傷且不能修復的細胞凋亡以及調節細胞增殖周期的作用，這對維持機體細胞正常增殖及保持基因組的穩定性具有重大意義[11]。此外，p53還能與某些序列的DNA發生特異性結合，參與其他細胞周期調控基因的激活過程，抑制原癌基因表達，進而抑制腫瘤的生長與轉移[12]。當HPV16、18E6促使p53喪失正常功能并發生降解，致使DNA受損的細胞異常增殖，最終導致癌變[13]。本研究結果顯示，宮頸癌組織中HPV16、18E6及p53的陽性表達率均高于正常宮頸組織，提示宮頸癌患者組織中HPV16、18E6及p53的表達水平呈上升趨勢。HPV16、18E6還能將自身病毒基因與宿主細胞的基因進行整合，通過細胞增殖而不斷繁殖，使機體內HPV16、18E6持續維持在較高水平[14]。HPV16、18E6蛋白具有特殊的鋅指結構域，這種特殊的結構域使HPV16、18E6具有與DNA、RNA結合，抑制其他細胞增殖調節蛋白作用，進而破壞細胞正常增殖周期的功能[15]。此外，HPV16、18E6還能通過抑制端粒酶抑制因子X1的表達，上調感染細胞中端粒酶活性，致使宮頸細胞失去增殖限制發生永生化增殖，引起癌變[16]。

本研究結果還顯示，宮頸癌組織中p53的表達水平與HPV16、18E6呈負相關，且HPV16、18E6在宮頸癌組織中的表達水平與患者年齡、組織學分級和病理分型有關，與TNM分期和淋巴結轉移情況無關；p53的表達水平與患者TNM分期和組織學分級有關，與年齡、淋巴結轉移和病理分型情況無關。

綜上所述，HPV16、18E6與p53蛋白在宮頸癌組織中的表達水平均呈上升趨勢，宮頸癌組織中p53的表達水平與HPV16、18E6呈負相關，HPV16、18E6通過誘導p53降解，促進宮頸癌的發生發展。此外，HPV16、18E6的表達水平與患者年齡、組織學分級和病理分型呈相關性，p53的表達水平與患者TNM分期和組織學分級呈相關性。