血清環狀RNA PTENP1、HIPK3聯合β-HCG在絨毛膜癌診斷和預后評估中的價值

張宇華 王曉彬 劉 佳 穆 鵬

絨毛膜癌是1種高度惡性的腫瘤，多繼發于葡萄胎、流產或足月分娩以后。早期絨毛膜癌癥狀不典型甚至無癥狀，隨著瘤體增大而表現不規則陰道流血、子宮變大而軟等癥狀，此時多已進展到中晚期[1]。目前，絨毛膜癌的篩查手段主要包括血清學指標人絨毛膜促性腺激素β亞基(β-Human chorionic gonadotropin，β-HCG)和超聲。然后，血清β-HCG缺乏特異性，其在多種生理、病理狀態下均會增高[2-3]；報道也指出B超對絨毛膜癌的診斷率僅為67.4%左右[4]。

環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類重要的非編碼RNA，其與癌癥的發生、發展及轉移密切相關，是近年研究的熱點[5]。研究發現多種非編碼RNA在絨毛膜癌患者體內存在異常表達，且與癌細胞增殖、侵襲與轉移等密切相關[6-7]，但關于circRNA在絨毛膜癌中的臨床價值卻尚未見報道。本研究旨在探討絨毛膜癌患者血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3聯合β-HCG的診斷及預后價值，以期為絨毛膜癌的診療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 研究對象的納入

收集本院2014年2月到2015年5月確診的絨毛膜癌患者140例，患者均為首次住院且經內鏡組織學檢查確診。絨毛膜癌的診斷和分期依據西班牙醫學腫瘤學會(SEOM)發布的2017版妊娠滋養細胞疾病臨床管理指南[8]。其中Ⅰ～Ⅱ期患者77例，Ⅲ～Ⅳ期患者63例；發生遠處轉移54例(陰道轉移39例、肺轉移7例、腦轉移4例、肝脾轉移4例)，未發生遠處轉移86例。同期選取我院體檢的健康女性140例。納入標準：①語言表達能力正常，能與調查人員進行正常的溝通；②研究對象自愿參與本研究。排除標準：①既往有其他腫瘤疾病史者；②排除腦卒中、老年癡呆等神經系統疾病導致的無法采集相關信息和精神分裂癥的患者；③孕婦或哺乳期女性。本研究的開展經醫院倫理委員會批準，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2 臨床資料與樣本的采集

由專業的研究人員記錄所有研究對象年齡、體重指數(body mass index，BMI)、吸煙史、飲酒史等基本信息。兩組間在年齡、BMI、吸煙史及飲酒史的差異均無統計學意義(P>0.05)，表明兩組間具有可比性，見表1。

使用促凝采血管收集經禁食10 h以上絨毛膜癌患者接受治療前及健康對照者入院體檢時的靜脈血5 ml。收集的標本在1 h內于4 ℃條件下以3 500 g離心力(離心半徑為10 cm)離心10 min，收集上層血清，并放入-80 ℃冰箱保存備檢測。

表1 兩組間臨床資料比較

1.3 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平的檢測

按照血清RNA提取試劑盒說明書步驟進行血清總RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-PCR)。RT-PCR按照SYBR GREEN說明書進行，反應體系為：Mix 10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.4 μl。熒光定量PCR循環條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個循環，每組設置3個復孔。應用PrimerPremier5.0進行PCR引物設計，使用的circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3與GAPDH引物序列見表2，引物合成由北京賽百盛基因技術有限公司提供。采用2-ΔΔCt法計算circRNAs的相對表達量，△Ct值=樣本Ct值-GAPDH Ct值。血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和GAPDH基因熔解曲線峰型單一，說明引物沒有形成引物二聚體，也沒有非特異性擴增。

血清β-HCG的檢測采用化學發光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供。質控品采用英國朗道公司腫瘤高、低值質控品，質控判斷標準為Westgard多規則分析。

同時計算血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG檢測的批內、批間變異系數值，以評估實驗的重復性和精確度。

表2 circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3與GAPDH的引物序列

1.4 隨訪

依據患者納入研究的時間，對患者進行40個月電話隨訪，并記錄患者的生存時間。隨訪終點為：①40個月內患者死亡；②40個月內患者退出該項研究；③40個月隨訪結束。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 兩組血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平比較

本次實驗血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG的批內變異系數分別為2.7%、2.6%、2.5%，批間變異系數分別為3.0%、2.8%、2.9%，均小于5%，提示樣本檢測具有良好的重復性和精確度。絨毛膜癌患者血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平顯著高于健康對照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組間血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平比較

2.2 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG與絨毛膜癌臨床特征的關系

如表4所示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平與絨毛膜癌患者年齡、吸煙史、飲酒史和BMI等因素均無明顯關系(P>0.05)。此外，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3水平與絨毛膜癌TNM分期(PTENP1：γ=0.514，P=0.004；HIPK3：γ=0.465，P=0.009)及遠處轉移(PTENP1：γ=0.501，P=0.005；HIPK3：γ=0.449，P=0.013)呈線性關聯。

表4 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG與絨毛膜癌臨床特征的關系

2.3 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對絨毛膜癌的鑒別價值

ROC曲線分析顯示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在區分絨毛膜癌與健康對照的AUC分別為0.841(95%CI：0.754～0.927，P<0.001)、0.815(95%CI：0.672～0.908，P<0.001)和0.612(95%CI：0.558～0.706，P=0.002)；在各指標約登指數為最大值時對應的靈敏度/特異度分別為：73.7%/90.7%、78.5%/86.9%和70.2%/59.3%；診斷界值分別為78.6(-log)、29.0(-log)和7.5 mIU/ml。聯合血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在區分絨毛膜癌與健康對照的AUC為0.923(95%CI：0.893～0.974，P<0.001)，靈敏度92.3%，特異度83.4%，見圖1。

圖1 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對絨毛膜癌鑒別價值

2.4 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對絨毛膜癌的風險評估

二元logistic回歸分析結果，見表5。單因素分析顯示，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平是絨毛膜癌發病的危險因素(P<0.05)；多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素后，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平仍是絨毛膜癌發病的獨立危險因素(P<0.05)。

2.5 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平與絨毛膜癌預后的關系

經40個月隨訪，共48例絨毛膜癌患者死亡，0例失訪。140例絨毛膜癌患者分別依據PTENP1、HIPK3和β-HCG水平的中位數分為高PTENP1與低PTENP1組、高HIPK3與低HIPK3組和高β-HCG與低β-HCG組。相比低PTENP1組，高PTENP1組生存率顯著降低(χ2=5.694，P=0.006，圖2A)；相比低HIPK3組，高HIPK3組生存率顯著降低(χ2=17.859，P<0.001，圖2B)；而低β-HCG組和高β-HCG組間生存率差異無統計學意義(χ2=1.173，P=0.216，圖2C)。

3 討論

絨毛膜癌的惡性程度高，侵襲能力強，是威脅女性人群健康的主要疾病之一。生物標志物是血液、尿液或者組織中能檢測疾病狀態的分子指標，可用于疾病的檢測[9]。它們在體液中的濃度變化可以提供疾病的進展情況，理想情況下，生物標志物應具有檢測早期小塊腫瘤的高敏感性、高特異性，并且在非腫瘤中不會增加。目前，絨毛膜癌診斷仍缺乏有效指標。β-HCG是絨毛膜癌輔助診斷的重要指標，但多種病理、生理狀態下β-HCG均可出現升高[10-11]：正常懷孕、雙胞胎，葡萄胎、或在內分泌疾病中如腦垂體疾病、甲狀腺功能亢進、婦科疾病如卵巢囊腫、子宮癌等；此外，其他系統實體瘤畸胎瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等β-HCG亦可升高。值得注意的是，本次研究我們也發現β-HCG用于鑒別絨毛膜癌與健康女性對照的特異度不高，僅為59.3%，這與早前報道β-HCG缺乏特異性相一致[10-11]。

circRNA是1類新型的基因調控因子，能與DNA、RNA或蛋白質結合，在轉錄或轉錄后水平，以順勢調控或反式調控的方式，調節基因的表達，參與幾乎人類所有的生理及病理性生物學過程，已被證實在多種腫瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌等中存在異常表達。血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3是近年研究發現的在女性乳腺癌及多個生殖系統腫瘤發生發展中起重要作用的促癌基因。研究先后指出，circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3的差異表達可直接對靶基因如miR-17、P53等轉錄后的調控而促進癌細胞的增殖、遷移，并抑制細胞凋亡[12-15]。Zheng等[12]通過收集并提取膀胱癌與健康者血清外泌體PTENP1發現，膀胱癌患者PTENP1水平顯著高于健康對照，且高水平PTENP1與膀胱癌患者不良預后相關。Yu等[13]的機制研究同樣證實，經脂質體轉染PTENP1 mimics于膀胱癌T24細胞以上調T24細胞中PTENP1的表達水平，觀察到上調PTENP1后可顯著下調下游靶基因miR-17的表達，進而促進T24細胞的增殖與遷移能力，并抑制癌細胞凋亡，提示PTENP1對膀胱癌癌細胞的生物學活性具有促進作用。近期，Chen等[14]的研究發現，PTENP1可通過AKT-MAPK通路促進乳腺癌上皮間質轉化及乳腺癌細胞的增殖和遷移。HIPK3作為促癌基因，有關價值研究也很深入。Li等[15]利用二代測序技術與生物信息學分析，在膀胱癌患者中篩選出了HIPK3，機制研究發現HIPK3在膀胱癌組織和細胞系中顯著上調，并分別與膀胱癌分級、浸潤和淋巴結轉移呈正相關，且過量表達HIPK3能有效促進膀胱癌細胞在體外的遷移、侵襲和血管生成，促進膀胱癌生長和轉移。然而，關于circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3在絨毛膜癌中的表達情況未見報道，其是否具有成為早期腫瘤診斷標志物的潛力是本次研究需要探討的。本研究通過對140例絨毛膜癌患者血清學的分析發現，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3在絨毛膜癌中顯著增高，此外，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3水平與絨毛膜癌患者分期和遠處轉移呈正相關，兩者在Ⅲ～Ⅳ期及發生遠處轉移患者中的水平增高最為顯著，提示兩者與絨毛膜癌的進展相關，該部分結果與前期研究基本相符[13-15]。

表5 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對絨毛膜癌的風險評估

注：a為校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素。

圖2 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平與絨毛膜癌預后的關系

進一步ROC曲線分析顯示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在區分絨毛膜癌與健康對照的靈敏度/特異度分別為73.7%/90.7%、78.5%/86.9%和70.2%/59.3%；而聯合三者后在區分絨毛膜癌與健康對照的靈敏度顯著提高，達到92.3%，提示聯合血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG具有較高的診斷價值。進一步二元logistic回歸分析顯示，在校正了年齡、BMI、吸煙、飲酒后，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平仍是絨毛膜癌發病的獨立危險因素，證實了血清miR-145、miR-29和miR-217水平差異可作為絨毛膜癌的診斷指標。生存分析結果提示，高PTENP1組和高HIPK3組患者的預后更差，這與前期多個研究結果相符[13-15]。然而，本次研究仍有如下不足：①本次研究納入的研究對象均來自于本院，這可能會對研究結果造成一定的偏倚影響，今后需要多中心的隊列研究來進一步驗證我們的結果；②本研究納入140例絨毛膜癌患者，納入的例數仍然是有限的，后期需要更大樣本量的研究來證實血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG的臨床價值。

綜上所述，本次研究發現聯合circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對絨毛膜癌的潛在診斷價值，并發現circRNA-PTENP1與circRNA-HIPK3在絨毛膜癌風險評估和預后評價中有重要意義，有望為絨毛膜癌的臨床診治提供新的途徑。