疲勞運動對大鼠腦缺血后額葉皮質腦血流量的影響

楊寓迪， 劉 琳， 王偉佳， 王冬雪， 張健松 ， 趙 瑛

腦卒中是嚴重威脅現代人健康的疾病，其致死率在所有疾病中居第三位[1]。腦卒中指由腦部血管破裂及阻塞引起血液循環障礙所導致的疾病，其中頸動脈狹窄或閉塞是20%～30%腦卒中患者的主要誘發因素[2]。其中缺血性卒中具有較高的致殘率[3]，腦卒中后腦血流量呈低灌注或血流減少等，會導致氧和能量供應中斷，神經細胞死亡并引發神經系統功能障礙[4]。隨著腦缺血情況的不斷加劇，由此引發的血管性癡呆已成為腦卒中困擾社會和家庭的主要并發癥之一[5]。

近年來體育運動逐漸成為青年人和老年人追捧的生活方式之一。有大量的研究報道指出適宜的運動能夠延緩心腦血管疾病的發生[6]。研究顯示適當的運動可以提高高血壓、超重、高膽固醇血癥和糖尿病患者的生存率[7]，降低認知障礙發生的風險[8]，對心血管疾病的預防作用顯著[9]。但也有許多人一味追求運動的時間和運動的強度，一旦運動強度超過人體負荷則表現為過度運動或疲勞運動。有研究表明，過度運動或疲勞運動可能會導致海馬出現細胞核固縮、深染，線粒體損傷以及海馬中腦腦源性神經營養因子表達的下調，海馬功能受損，引起記憶能力下降等問題[10]。

本文采用雙側頸總動脈結扎的方法建立大鼠腦缺血模型，并于腦缺血前進行大鼠疲勞運動訓練。采用雙通道激光多普勒腦血流儀對其腦血流量進行測定，采用Morris水迷宮實驗對大鼠的學習記憶情況進行測定，分別觀察疲勞運動對正常及腦缺血大鼠腦血流量和學習記憶功能的變化情況。為疲勞運動對腦卒中后的病程影響提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級成年健康雄性Wistar大鼠120只，體重為180～240 g。由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，合格證編號：201700018990。實驗動物采用標準飼料喂養，實驗期間自由飲水、攝食。

適應性飼養1 w后，根據體重分層隨機分為4組：陰性對照組(SO，n=20)，疲勞運動組(OE，n=20)，雙側頸總動脈結扎組(2-VO，n=40)，雙側頸總動脈并疲勞運動組(OE+2-VO，n=40)，訓練2 w后對2-VO組及2-VO+OE組進行雙側頸總動脈結扎，建立模型。

1.2 實驗方法

1.2.1 疲勞運動模型的建立 動物跑臺是依鼠跑步運動而設計的實驗裝置，運動強度可通過調整跑步的時間、跑步速度以及跑臺的坡度來控制，大鼠適應性飼養后開始訓練，采用遞增強度跑臺運動，坡度為15°，將大鼠放置在跑道后，初始速度為5 m/min，逐漸加速，直到增速至30 m/min，跑至力竭，以120 min為期限，1次/d，訓練14 d，記錄大鼠完成訓練的情況，建立疲勞運動模型[11]。SO組和2-VO組僅將大鼠置于跑臺上但不轉動跑臺。

1.2.2 腦缺血模型的建立 疲勞運動后對2-VO組及2-VO+OE組采用永久性結扎雙側頸總動脈(2-VO)的方法建立腦缺血大鼠模型。手術組大鼠術前12 h禁食、4 h禁水。用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開，分離暴露左、右側頸總動脈，套以“0”號絲線雙重結扎，逐層縫合，SO組及OE組大鼠除不結扎頸總動脈，其余同手術組。術后每天肌肉注射青霉素[12]。

1.2.3 大鼠額葉皮質腦血流量的測定 腦血流量實驗前的預處理：實驗前1 w，所有大鼠麻醉后俯臥，放置于腦立體定位儀上，固定頭部，采取平顱固定法進行大鼠頭顱的立體定位。之后頭部剃毛，剪開頭部皮膚2 cm，用過氧化氫擦拭清除軟組織，暴露出顱骨。參照Paxions-Watson大鼠腦立體定位圖譜(第6版)[13]，確定額葉(FrA)位置(中心點為前囟前5 mm，矢狀縫右側旁開2 mm)，為后期正式實驗做準備。

分別于疲勞運動訓練或雙側頸動脈結扎14 d后，采用moorVMS雙通道激光多普勒腦血流儀進行腦血流量的測定[14]。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉20 min后，將多普勒光纖探頭固定至額葉處，記錄腦血流量、紅細胞聚集度、紅細胞運動速度、回光強度等，測試時間為10 min。腦血流量的單位采用的是血流灌注單位PU，紅細胞聚集度、紅細胞運動速度、回光強度的單位為AU。

1.2.4 學習記憶能力的測定 腦血流測定28 d后進行Morris水迷宮測試[15]：實驗前分別在水池四個方向貼上不同標記物，分別為三角形，正方形，圓形和五角星紙片。放入平臺，使平臺低于水面2 cm，控制水溫在(20.0±2.0)℃。實驗開始前移除平臺，將大鼠放入池內適應環境，避免有刺激對大鼠造成應激反應。

定位航行實驗：每天相同時間點進行實驗，將大鼠隨機從不同象限(除目標象限)面壁置入池內，記錄120 s內尋找平臺的時間即逃避潛伏期，逃避潛伏期下降表示學習記憶增強。如果大鼠在120 s內找到平臺，記錄120 s內實際逃避潛伏期；如果在120 s 內未找到平臺，由實驗者將其引上平臺并停留30 s，以熟悉環境，逃避潛伏期記錄為120 s。大鼠每天訓練2次[16]，連續訓練5 d，然后進行定位航行測試。

空間探索實驗：將平臺移除，記錄大鼠穿越平臺次數。每次訓練完成后將小鼠取出擦干，以防止低體溫造成的應激。測試過程中保持實驗室內燈光、物品等空間參照物擺放位置不變，排除干擾因素對實驗結果的影響。

可視平臺實驗：將水迷宮內水排出部分，使水面低于平臺1～2 cm，在平臺處放置一個小旗，其余同定位航行實驗。

2 結 果

2.1 疲勞運動時期大鼠運動完成情況結果 大鼠疲勞運動完成百分率見圖1，在訓練最初的7 d時間內，絕大多數大鼠不能在120 min內完成訓練，表明這種強度對大鼠來說屬于疲勞運動。隨著訓練周期的延長，部分大鼠均能順利完成，訓練10 d以后除有個別大鼠因身體素質原因不能完成外，其它大鼠能夠完成120 min的訓練。

圖1 完成訓練大鼠的百分率(%)

2.2 腦血流量及其相關參數的實驗結果 運動2 w后，與SO組相比，OE組腦血流量顯著升高(P<0.05)，2-VO組血流量顯著降低(P<0.01)，與2-VO組比較，OE+2-VO組腦血流量顯著降低(P<0.01)。結果提示，腦缺血后大鼠腦血流量顯著下降，但疲勞運動后的腦缺血大鼠腦血流量下降更為明顯，即使疲勞運動會使腦血流量有小幅度回升，這種情況也不能緩解。這種腦血流量的大幅度下降提示疲勞運動可能使得腦血流的損傷加劇。與2-VO組比較，OE+2-VO組紅細胞運動速度顯著降低(P<0.01)，結果提示疲勞運動合并腦缺血后腦血流量的顯著下降可能與紅細胞運動速度下降有關。與OE組比較，OE+2-VO組紅細胞聚集度顯著下降(P<0.05)。回光強度是反向散射光強度的指標，受屋內光強度的影響，可以實時監測探頭的狀況，與腦血流量成反比例，固保持回光強度一致，使腦血流量不受光強的影響，在本實驗中回光強度各組大鼠之間無顯著差異(P>0.05)，所測得的腦血流量值較為準確(見表1)。

表1 血流量及相關參數測定結果

與SO組相比*P<0.05有顯著性差異**P<0.01有非常顯著性差異；與OE組相比▲P<0.05有顯著性差異▲▲P<0.01有非常顯著性差異；與2-VO組相比，●P<0.05有顯著性差異●●P<0.01有非常顯著性差異

2.3 Morris水迷宮學習記憶測試結果 模型建立后42 d后，對各組大鼠進行Morris水迷宮測試(見表2)，與SO組相比，OE組逃避潛伏期和穿臺次數無顯著差異(P>0.05)，2-VO組和OE+2-VO逃避潛伏期顯著增加，穿臺次數顯著降低(P<0.05)，與2-VO組相比，OE+2-VO組逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)。說明運動對大鼠的學習記憶并無明顯的影響，但腦缺血42 d后動物的學習記憶能力會顯著下降，運動后腦缺血的動物學習記憶障礙更為明顯。平均速度結果顯示各組大鼠的平均速度無明顯變化(P>0.05)，排除了由于動物自身的因素對實驗結果造成的影響。

表2 各組大鼠Morris 水迷宮測試期結果

與SO組相比*P<0.05有顯著性差異**P<0.01有非常顯著性差異；與OE組相比▲P<0.05有顯著性差異▲▲P<0.01有非常顯著性差異；與2-VO組相比●P<0.05有顯著性差異●●P<0.01有非常顯著性差異

3 討 論

目前大多數文獻關于建立過度運動或疲勞運動的模型采取的方式主要有兩種：強迫游泳及跑臺訓練[17]。在本實驗中，因后期要采用Morris水迷宮對大鼠的學習記憶能力進行測試，強迫游泳實驗可能會對其造成干擾，且腦血流前對大鼠的頭部要進行預處理，為了防止傷口感染，故而本實驗采用動物跑臺建立疲勞運動模型。在訓練最初的7 d時間內，絕大多數大鼠不能在120 min內完成訓練，表明這種強度對大鼠來說屬于疲勞運動。但隨著大鼠適應能力的不斷加強，10～14 d絕大多數大鼠均可完成訓練，因此將疲勞運動訓練時間定為14 d。這種做法既能減少大鼠的死亡率，又符合大鼠疲勞運動病理過程。SO組和2-VO組僅將大鼠置于跑臺上但不轉動跑臺，排除應激反應可能造成的影響。

腦血流的主要功能是運輸物質和氧氣，以及帶走廢物和過多的熱量，腦血流量的變化是很多腦血管疾病的病理生理基礎之一[18]。研究結果顯示疲勞運動合并腦缺血后可造成腦血流量的顯著下降，且這種下降程度要大于單純結扎造成的腦血流的下降。提示疲勞運動合并腦缺血可能造成更為嚴重的腦損害，這種下降可能與紅細胞運動速度下降有關，與紅細胞聚集濃度無關。

研究發現腦部血流量供應不足會導致白質疏松，以白質的退行性改變為主要特點[19]，從而導致機體神經功能損傷、學習記憶功能障礙等，且在腦缺血42 d為損傷關鍵點[15]。因此本實驗采用Morris水迷宮測定大鼠學習記憶功能，評價疲勞運動對大鼠腦缺血后行為功能的影響。結果發現雙側頸總動脈結扎42 d后大鼠會出現學習記憶障礙，與文獻報道相吻合[15]。額葉皮質與注意力、短時記憶任務、推理感等高級心理活動有關，在非任務的長期記憶保持中也起著非常重要的作用。額葉皮質缺血會出現學習記憶障礙[20]。這一點在本實驗中也得到驗證。研究結果發現大鼠的學習記憶功能與額葉皮質腦血流量呈現一定的正相關。經雙側頸總動脈結扎后的大鼠會出現學習記憶障礙，而在結扎之前進行疲勞運動訓練的大鼠腦血流量下降幅度更大，其出現學習記憶障礙的程度也較單純的結扎頸總動脈要深，可能因為運動的強度過大導致了大鼠海馬細胞的凋亡增加，從而加重了學習記憶障礙的發生[9]。

適度運動能夠強身健體，改善自身的血液循環，但對于剛開始鍛煉的人來說，要結合自身的條件進行運動，近來，運動過程中猝死的事件也屢見不鮮，“暴走”作為運動中的一項，也曾經引起過熱議，對于不常運動的人來說，不少人在此之前并未參加過規律性的體育鍛煉，就進行10～20千米以上的運動，除了對機體運動系統產生損傷外，還會加大神經細胞損傷和凋亡的風險，若是患有認知障礙疾病后，其發展成癡呆的速度也會較快，故應該結合自身的條件，選擇適宜自己的運動，在運動期間也應該循序漸進，避免過度的疲勞運動對機體造成的損傷。