睡眠剝奪小鼠海馬中BDNF、IL-4變化的研究

張 勇， 宋 贊， 孫曉倩， 張 軒， 薛 蓉， 吳 偉

睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)是指由于環(huán)境或自身的生理、心理原因所導致的正常睡眠部分或全部喪失的過程和狀態(tài)。目前應用最多動物睡眠剝奪模型的則是改良多平臺水環(huán)境法[1](modified multiple platform method，MMPM)。睡眠剝奪可引起情感、認知等多種功能障礙，海馬是認知記憶功能維持的重要結構，但睡眠剝奪后海馬中細胞因子的動態(tài)變化規(guī)律的研究相對較少。

為進一步確定細胞因子在睡眠剝奪機制中的作用，本研究選用小鼠MMPM模型，觀察BDNF和IL-4的在急性睡眠剝奪的海馬組織的動態(tài)變化情況，探討細胞因子BDNF和IL-4與急性睡眠剝奪的關系。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 酶標儀(美國 Bio-Rad公司)。Mouse-IL-4 ELISA Kit、Mouse-BDNF ELISA Kit(上海嵐派生物)。

1.2 動物分組 實驗動物為雄性C57BL/6J小鼠，共60只，均為6～8 周齡，體重在 20～25 g 之間，經(jīng)中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所質量檢測合格，并獲得天津醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會的批準。C57BL/6J雄性小鼠經(jīng)同籠性飼養(yǎng)1 w后隨機分為正常對照組(CC)、快速眼球運動(REM) 睡眠剝奪1 d組(SD 1 d)、REM 睡眠剝奪2 d組(SD 2 d)、REM 睡眠剝奪3 d組(SD 3 d)，每組12只小鼠。

1.3 小鼠REM 睡眠剝奪模型的建立 睡眠剝奪室保持光照(9：00～21：00)與黑暗(21：00～次日9：00)交替，光照由 40 W 日光燈照射模擬。室內溫度(24±1) ℃，相對濕度 40%～70%。小鼠REM睡眠剝奪模型MMPM建立。睡眠剝奪箱為50 cm×30 cm×30 cm的水箱，均勻地放置8個圓形平臺，每次放入6只小鼠，空閑兩個平臺，小鼠可自由活動。向箱內加入清水至平臺下方約1 cm，保持水溫20～25 ℃。箱上放置網(wǎng)蓋，保證小鼠不能跳出。

實驗開始前1 w將小鼠同籠飼養(yǎng)，并在水平臺上進行環(huán)境適應。SD 1 d 組、SD 2 d組、SD 3 d組睡眠剝奪時間分別為24 h、48 h和72 h。用攝像頭觀察記錄小鼠睡眠剝奪的全過程，小鼠確實存在低頭觸水而驚醒的反應。

1.4 標本制備 待4組小鼠各自處理完畢后，分別隨機取出小鼠，以10%水合氯醛腹腔內注射，剪開胸腔，暴露心臟、肺及肝臟，剪開右心耳，將頭皮針插入左心室，頭皮針另一端連接預先于4 ℃預冷的100 ml 0.1 mol/L PBS，快速灌注，待灌流出的液體變淡直至清亮無色，此時肺及肝臟變白時提示灌注充分，停止灌注。將小鼠斷頭后取出腦組織，分離出雙側海馬，投入液氮中速凍，然后于-80℃凍存。

1.5 ELISA法 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定海馬組織勻漿液中BDNF、IL-4表達水平。測定儀器為瑞士infinite M200 Pro 酶標儀。操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 ELISA 法檢測不同時長睡眠剝奪小鼠海馬中 BDNF表達水平 小鼠海馬中BDNF的表達水平方差分析顯示SD 1 d組(561.583±25.279)pg/ml較CC組(516.417±24.481)pg/ml升高，差異具有顯著性(P=0.029)；SD 2 d組(509.150±31.469)pg/ml與CC組相比稍有降低，但差異并無顯著性(P>0.5)，與SD 1 d組相比降低，差異具有顯著性(P=0.009)；SD 3 d組(442.650±14.446)pg/ml與CC組相比降低，差異具有顯著性(P<0.001)，與SD 1 d組相比顯著降低(P<0.001)(見表1、表2、圖1)。

2.2 ELISA 法檢測不同時長睡眠剝奪小鼠海馬中 IL-4表達水平 小鼠海馬中IL-4的表達水平方差分析顯示SD 1 d組(111.767±4.199)pg/ml較CC組(96.217±3.279)pg/ml升高，差異具有顯著性(P<0.001)；SD 2 d組(90.983±2.586)pg/ml與CC組相比稍降低，但差異并無顯著性(P=0.13)，與SD 1 d組相比降低，差異具有顯著性(P<0.001)；SD 3 d組(75.967±4.227)pg/ml與CC組相比降低，差異具有顯著性(P<0.001)，與SD 1 d組相比顯著降低(P<0.001)(見表1、表2、圖2)。

2.3 Pearson相關性分析顯示睡眠剝奪過程中小鼠海馬中IL-4、BDNF蛋白表達變化呈正相關性 Pearson相關性分析顯示睡眠剝奪過程中小鼠海馬中IL-4、BDNF蛋白表達變化呈正相關性，P<0.001，相關系數(shù)r=0.863(見圖3)。

表1 不同時長睡眠剝奪小鼠海馬組織ELISA結果(單位pg/ml)

表2 不同時長睡眠剝奪小鼠海馬組織ELISA方差分析

圖1 不同時長睡眠剝奪小鼠海馬組織BDNF含量

*P<0.05；**P<0.005

圖3 不同時長睡眠剝小鼠海馬BDNF、IL-4蛋白表達量相關性分析

3 討 論

急性短時間的睡眠剝奪與饑餓、創(chuàng)傷、缺氧等因素一樣，是一種應激源，可造成機體的正常生理紊亂[2]。有實驗表明，機體的應激反應可以最終整合到海馬區(qū)，從而對機體的學習、記憶有著重要的作用[3]。本實驗顯示，急性睡眠剝奪24 h后小鼠海馬中BDNF蛋白表達水平稍有升高，與既往研究[4]顯示短時間的睡眠剝奪對導致BDNF水平的上調相一致。可能與睡眠剝奪后體內多種內分泌系統(tǒng)激活，導致諸如多巴胺、去甲腎上腺素等激素上調有關[5]。本實驗顯示，隨睡眠剝奪時間的延長，海馬中BDNF水平逐漸下降。睡眠剝奪48 h時蛋白表達水平與對照組相比稍低(差異無統(tǒng)計學意義)；當睡眠剝奪達到72 h時蛋白表達水平較對照組明顯降低。BDNF表達的減少，使BDNF對神經(jīng)元的有益作用減弱，對細胞功能造成影響。BDNF對海馬組織有重要的保護作用。BDNF在神經(jīng)細胞中的作用是通過與TrkB受體和p75受體結合而實現(xiàn)的。BDNF與TrkB受體結合后激活Ras/MEK、PI-3K/AKT、PLCc/PKC和PKA等多種信號傳導途徑[6]。BDNF的表達減慢了淀粉樣前體蛋白(APP)轉基因小鼠細胞變性的速度，降低細胞變性的程度，減弱Aβ 沉積造成的神經(jīng)毒性損害[7]。BDNF可引起腦啡肽酶介導的 Aβ 降解，保護神經(jīng)細胞[8]，通過Neuropep-1外源性上調BDNF表達，可提高TrkB的水平并減少淀粉樣斑塊的形成[9]。研究表明大腦神經(jīng)元BDNF表達水平較低的區(qū)域，神經(jīng)元纖維纏結增多[10]。Alzoubi等研究表明SD可以降低BDNF水平并損害記憶[11]。另有研究表明睡眠剝奪對海馬細胞增殖的不利影響可能在約48 h之后出現(xiàn)[12]。本研究證明較長時間的睡眠剝奪(72 h)降低了海馬中的BDNF水平，這可能是由于機體對睡眠剝奪后的應激反應隨著時間的延長逐漸衰減的結果，也有可能是睡眠剝奪造成海馬功能損傷導致記憶及認知功能障礙的發(fā)病機制之一。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，IL-4主要是由M2表型的神經(jīng)膠質細胞產生的，IL-4水平的升高表明刺激朝向小膠質細胞M2表型分化[13]。有實驗表明，通過暴露于IL-4誘導M2表型，小膠質細胞的iNOS的表達水平顯著下調[14]。IL-4可通過調節(jié)急慢性巨噬細胞反應發(fā)揮神經(jīng)保護作用[15]。IL-4可以促進小膠質細胞的生長，增強吞噬活性并促進增殖，能抑制一氧化氮(NO)和促炎細胞因子如TNF-α和IFN-γ的產生[16]。IL-4在AD患者腦內的神經(jīng)炎性反應過程中發(fā)揮重要作用[17]。然而，在急性睡眠剝奪時，大腦尤其是海馬中的IL-4的變化研究相對較少。本研究顯示，24 h的急性睡眠剝奪引起小鼠海馬中蛋白表達水平較對照組升高；48 h睡眠剝奪后小鼠海馬中的蛋白表達水平與對照組相比無明顯差異；當睡眠剝奪達到72 h后，小鼠海馬中的蛋白表達水平較對照組降低。本研究顯示，隨著睡眠剝奪時間的延長，海馬中IL-4的水平顯示出先升高后降低的變化，這可能表示短時間(24 h)內的睡眠剝奪時，神經(jīng)膠質細胞向M1表型轉化時同樣可以部分地向M2表型轉化，升高IL-4水平以抵消M1表型引起的負性作用，這可能是機體的自我保護機制；當睡眠剝奪時間延長至72 h時，IL-4水平降低，表明拮抗M1表型分泌的促炎因子的損害作用可能減弱，這造成了一定程度的炎癥失衡。有研究表明IL-4缺陷型小鼠表現(xiàn)出明顯的認知功能障礙[18]，因此睡眠剝奪造成IL-4動態(tài)變化可能是引起認知功能損害的機制之一。

本實驗顯示，在睡眠剝奪過程中，小鼠海馬組織中的IL-4和BDNF蛋白表達量具有相同的先高(24 h)后低(72 h)的趨勢，由此，本研究對兩者是否具有相關性進行了進一步的探討。本實驗數(shù)據(jù)的Pearson相關性分析顯示，在小鼠睡眠剝奪過程中，海馬組織內IL-4和BDNF蛋白表達量存在明顯的正相關關系。IL-4與BDNF的相關性在其他疾病的研究中已有證實。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)體外實驗中，IL-4的應用引起了BDNF水平升高并促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的存活[19]；在體內實驗中，直接向老年大鼠海馬區(qū)注射IL-4可引起大鼠海馬組織中BDNF水平的上調并改善認知功能[20]。另有實驗直接證明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的IL-4誘導的M2型小膠質細胞分泌BDNF增加[21]。這些研究均表明，IL-4與BDNF之間具有正相關的關系，IL-4可以促進海馬內BDNF的產生，這可能是IL-4產生保護性作用的另一機制。

綜上，本實驗通過ELISA法證明隨著睡眠剝奪時間延長，小鼠海馬組織內的BDNF、IL-4呈現(xiàn)先高后低的趨勢；睡眠剝奪后BDNF、IL-4表達量的變化可能是睡眠剝奪后造成神經(jīng)損傷的可能機制之一。