急性腦梗死患者血漿代謝物的相關性分析

由 楊， 段克非， 楊 銳

腦卒中是一種常見的具有高復發率、高致殘率、高死亡率特點的腦血管疾病[1]。而急性缺血性腦卒中占腦卒中的60%～80%，它是由于各種原因導致腦組織血液供應障礙，并由此產生腦組織缺血缺氧性壞死，進而出現神經功能障礙的一組綜合征[2]，給人們的生活質量帶來極大的影響，故發現一些操作簡單，快速可靠且具有臨床預測價值的生物學標記物顯得尤為重要。

代謝組學(metabolomics)是繼基因組學和蛋白質組學后，致力于研究整個生物體的動態代謝狀態，被定義為“生物體對病理生理刺激或基因改變而產生的代謝物質變化的定量測定”，是由Nicholson[3]早期所提出。該組學采用化學計量方法分析疾病導致的某些代謝物的改變，判斷疾病組和正常對照組差異，了解疾病的代謝途徑，尋找與疾病相關的生物標記物，從而對疾病的輔助診斷與治療提供幫助。據報道，代謝組學技術應用于多種疾病的診斷與治療中，如糖尿病腎病[4]、結核病[5]、胃腸道腫瘤[6]等疾病。然而目前，應用基于代謝組學分析的串聯質譜技術探討血漿代謝物濃度改變與腦梗死發病的相關性文獻相對少見。本文通過分析腦梗死組和對照組的代謝譜，尋找兩組間的差異性代謝物。發現具有預測價值的代謝標記物，可以加深我們對疾病的認識，進而為臨床治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究主要納入2017年5月～2018年11月就診于錦州醫科大學附屬第一醫院的患者，分為研究組和對照組。急性腦梗死患者入選標準參照《中國急性缺血性腦卒中指南診斷標準2014》[7]，本研究中腦梗死組患者入選標準：(1)急性神經功能缺損癥狀出現小于1 w；(2)頭部核磁共振彌散加權成像(DWI)確定為新發腦梗死；(3)美國國立衛生研究院卒中評分量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)[8]分數大于4分。對照組患者入選標準：(1)同期同年齡段健康體檢者；(2)無神經功能缺損癥狀；(3)頭部CT/MRI排除近期梗死病灶。排除標準為：(1)腦出血(包括出血性腦梗死、腦室出血、蛛網膜下腔出血或硬膜外血腫等)患者；(2)存在感染、創傷、昏迷；(3)嚴重肝腎疾病及惡性腫瘤；(4)近期大手術。本研究經錦州醫科大學附屬一院倫理委員會審查和批準，所有受試者均為自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法 所有受試者上午7時左右(住院患者入院次日)，于空腹條件下采集指尖血，滴入串聯質譜儀(AB SCIEX 4000)檢測專用濾紙片的3個孔板中，形成直徑大于8 mm且分布均勻的血斑，晾干后送檢。應用串聯質譜儀對所有樣本進行代謝組學分析，樣品檢測方法詳見參考文獻[9]，共測得93個指標(包括23種氨基酸、35種肉堿和35個比值)。詳細詢問并記錄受試者一般臨床資料(年齡、性別、既往史、吸煙史和飲酒史)。

2 結 果

2.1 患者臨床資料 本研究納入340例患者，其中研究組200例，對照組140例。患者的一般臨床資料見表1。

2.2 OPLS-DA回歸模型 應用OPLS-DA方法分別對對照組和研究組患者血漿代謝物數據進行分析，得到相應的散點分布圖(見圖1)。對照組和研究組沿橫軸(t軸)方向能明顯分開(R2Y=0.583、Q2Y=0.636)，說明其預測能力和解釋能力較強。本研究中Permutation試驗證明累計的R2和Q2值(左下部)明顯低于原始的R2和Q2(右上部)(見圖2)。可以證實OPLS-DA模型是穩定的、有效的。[截距：R2(0.0，0.176)，Q2(0.0，-0.295)]。

圖1 OPLS-DA散點圖(1.腦梗死組：綠色；2.對照組：藍色)

圖2 Permutation實驗

2.3 篩選組間差異性代謝物 篩選血漿中93個代謝物指標。共同滿足VIP>1.0、AUC>0.7、P<0.01條件的指標共13個(見表2)。分別是Arg、C26、Cit/Arg、C3DC、C18：1、C10：1、C4/C8、Met/Phe、C5-OH/C8、Leu、C4DC、C16：1-OH、C14：2。

2.4 篩選與腦梗死發病的相關性代謝物 進一步篩選與腦梗死相關的差異性代謝物，將表2中的13個代謝物納入Logistical回歸模型，篩選出差異性指標(P<0.05)。最終有8個指標納入模型，分別是Leu、Cit/Arg、Arg、Met/Phe、C4/C8、C4DC、C18：1、C26。并得到回歸方程式Y=4.353*C18：1+0.012*Leu-0.748*C4/C8+0.620*Cit/Arg-0.235*Arg+8.461*Met/Phe-3.474*C4DC+70.484*C26-10.285。根據此方程式，我們計算一個綜合性指標N。篩選出的8個代謝物和綜合性指標N在兩組間的表達量詳見小提琴圖(見圖3)和相關性圈圖(見圖4)。

2.5 檢驗模型預測疾病的準確性 應用ROC曲線圖預測模型的精準性。其AUC值越大，代表模型預測的準確性越高(見圖5)。設定的新指標N為8種代謝物的綜合性指標，其AUC值為0.977，大于其他所有代謝物的AUC值，提示結合多種代謝物會提高對疾病的診斷價值。

表1 患者一般臨床資料

注：a應用卡方檢驗；b應用獨立樣本t檢驗

表2 篩選兩組主要差異指標

由左上至右下指標分別為：N、Leu、Cit/Arg、Arg、Met/Phe、C4/C8、C4DC、C18：1、C26

圖4 相關性圈圖

圖5 ROC曲線

3 討 論

多年來，腦梗死的發病率及病死率在全球范圍內始終居高不下，尋找新的診治方案迫在眉睫。近年來，代謝組學是一種很有前途的檢測方法，廣泛的應用于各種疾病的診治。因此，本研究選定氨基酸和肉堿為相關的代謝物，并對其量化，比較研究組與對照組之間代謝譜差異，為疾病早期而準確的診斷提供有力的幫助。

本研究對血漿代謝物進行多次篩選，最終得到8個指標與腦梗死密切相關，分別是：亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸/精氨酸、甲硫氨酸/苯丙氨酸、C18：1、C26、C4DC、C4/C8。本文結果顯示亮氨酸、瓜氨酸/精氨酸、甲硫氨酸/苯丙氨酸、C18：1、C26含量在腦梗死組較低，而精氨酸、C4DC、C4/C8含量較高。

3.1 氨基酸：亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸/精氨酸、甲硫氨酸/苯丙氨酸 亮氨酸：亮氨酸為生酮氨基酸，也是支鏈氨基酸(branched chainaminoacids，BCAA)，包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸，是直接或間接影響代謝的重要營養信號[10]。亮氨酸越來越多的應用于腦血管疾病的診治中，為疾病提供可靠的信息。其機制可能為亮氨酸代謝酶基因的表達存在異常，從而導致血漿亮氨酸水平升高[11]。Kimberly等[12]發現無論是人或者動物的缺血性腦卒中，亮氨酸水平都有所下降[13]。同樣Lee等[14]研究發現，在急性缺血性卒中患者的血漿和腦脊液中觀察到支鏈氨基酸水平下降。以上研究結果均與本文研究結果相一致。此外，Nachbaue 等[15]發現對術后、創傷和各種疾病患者，運用合適的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸比例的氨基酸液能明顯改善氮平衡營養狀況，從而有利于患者的傷口愈合和機體恢復。

精氨酸(Arg)、瓜氨酸/精氨酸(Cit/Arg)：本文中Cit/Arg在腦梗死組含量低，而Arg含量高。研究表明在瓜氨酸和一氧化氮(NO)之間存在一種動態平衡稱作瓜氨酸-一氧化氮循環[16]。當Arg缺乏，N0合成會減少，機體將加快對Arg轉運以促進NO合成，來滿足機體正常代謝需求，當NO合成速率加快，終產物NO和Cit生成增多，過多的終產物若不及時清除，將導致Cit堆積，堆積的Cit與Arg相互競爭酶的結合位點，從而抑制NO生成，最終導致NO、Cit生成均下降。Cherian[17]和丁俊麗[18]發現在大鼠腦缺血早期使用左旋精氨酸可以加速缺血區域NO含量，對腦起保護作用。本研究得出的結果可能與氨基酸代謝途徑異常或Cit-NO循環被破壞相關。此外，NO屬于一類重要的內皮功能舒張調節因子，其與高血壓的發生發展過程密切相關[19]，同時NO可產生過多的氧自由基，加重血管內皮細胞損傷[20]。

甲硫氨酸/苯丙氨酸(Met/Phe)：本文研究結果提示，在腦梗死組Met/Phe含量低。甲硫氨酸參與甲硫氨酸循環，在此循環中甲硫氨酸提供SAM，SAM轉甲基后轉變為SAH，進一步水解生成同型半胱氨酸，Hcy可促進動脈粥樣硬化發生及血栓形成[21]，促進腦梗死形成。苯丙氨酸為芳香族氨基酸。研究發現，血液中苯丙氨酸水平增高，腦電圖異常率明顯增高，不同程度的增加腦缺血的發生[22]。鄒卉等[23]發現高苯丙氨酸加重患兒腦缺血和不同程度的腦損傷。結合上文所述，低水平的Met、Phe或Met/Phe可能對人體有利，可能會減少腦梗死的發生。

3.2 肉堿：長鏈酰基肉堿(C18：1、C26)、短鏈酰基肉堿(C4DC、C4/C8) 人體內肉堿根據碳含量可分為長鏈酰基肉堿和短鏈酰基肉堿，主要存在于心肌、骨骼肌等肌肉中。研究指出，肉堿有重要生理的作用：(1)參與脂肪酸β氧化，提高代謝率；(2)抗氧化作用；(3)參與支鏈氨基酸代謝[24]。本文研究顯示在腦梗死組C18：1、C26較低，而C4DC、C4/C8較高。在脂肪酸β氧化中，若肉堿(CO)缺乏或肉堿轉移酶異常，將導致脂質代謝障礙，加重微小血管損害，有可能誘發腦梗死。Deutsch 等[24]研究得出長鏈酰基肉堿含量在腦梗死組和正常組大鼠腦之間沒有差異。Slivka等[25]研究表明長鏈酰基肉堿含量未改變也未減少腦梗死面積的大小。以上均與本文研究結果有所差異，具體機制仍需進一步探討。Rousseau等[26]研究發現在缺血時，短鏈酰基肉堿含量有所增加，且與血漿支鏈氨基酸(BCAA)水平顯著相關，且P<0.001，對腦細胞起保護作用，減少腦缺血的發生。與本文研究結果一致。此外，國外有研究發現左旋肉堿和乙酰化衍生物乙酰基左旋肉堿可以改善成人、新生兒和小兒腦損傷模型中的能量狀態，減少氧化應激并防止隨后的細胞死亡。

綜上所述，亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸/精氨酸、甲硫氨酸/苯丙氨酸、肉堿(C18：1、C26、C4DC、C4/C8)等代謝物指標在腦梗死組和對照組中有所差異。腦梗死患者體內氨基酸和肉堿代謝異常，打破了體內正常物質能量轉運代謝庫，進而出現代謝障礙。對于癥狀輕微或隱匿的人而言，若能檢測出這些異常的氨基酸和肉堿代謝指標，對于腦梗死的診斷和預防有一定的指導意義。本文研究不足之處在于，不能將全部與腦梗死相關的代謝指標進行建模，且樣本量較少。需擴大樣本量，進一步證實這些異常代謝指標與腦梗死發病的相關性。對于人為干預某些氨基酸和肉堿濃度能否降低腦梗死的發病仍需進一步研究。