腫瘤免疫中CD4+CD25+CD127low/-調節(jié)性T細胞作用研究

吳彬 梁華山 趙海霞 楊睿霞 郭亮

腫瘤免疫是指機體免疫系統(tǒng)有效識別、殺傷腫瘤細胞的一系列正常生理過程。當免疫系統(tǒng)識別、激活免疫應答能力降低時，就會出現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）是在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負向調節(jié)作用的細胞，擁有免疫無反應性和免疫抑制兩大功能[1]。CD4+CD25+CD127low/-Treg 細胞與腫瘤免疫逃逸密切相關，具有抑制CD4+T 細胞和CD8+T 細胞活化、增殖的作用。叉頭翼狀螺旋轉錄因子（Foxp3）與免疫調節(jié)相關，在細胞的分化和功能維持方面具有重要作用，是Treg 細胞的特異性標記[2]。CD127與Foxp3 在調節(jié)性T 細胞表面表達呈負相關，選擇CD127low/-作為Treg 細胞標記可排除CD25+的效應性T 細胞，更真實反映Treg 細胞水平[3]。本研究采用流式細胞術檢測癌癥患者與正常健康人群外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 比例，同時通過RTPCR 方法檢測Foxp3 表達情況，探討Treg 細胞在腫瘤免疫中的意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月～2017年12月就診于我院的78 例癌癥患者，男45 例，女33 例；年齡39～87 歲，中位年齡51 歲，所有病例均經(jīng)病理診斷證實，臨床分期根據(jù)國際抗癌協(xié)會標準，其中肺癌33例、胃癌12 例、結直腸癌10 例、乳腺癌8 例、多發(fā)性骨髓瘤7 例、非霍奇金氏淋巴瘤6 例，腎癌2 例。其中I～II 期42 例，III 期20 例，IV 期16 例；入選者均未接受其他治療。對照組68 例，來自健康體檢人群，男38 例，女30 例；年齡35～72 歲，中位年齡45 歲。

1.2 主要試劑 FITC （Mouse Anti-Human） CD4 抗體、APC（Mouse Anti-Human）CD25 抗體、PE（Mouse Anti-Human）CD127 抗體、溶血素購自美國BD 公司，PCR 試劑購自德國QIAGEN 公司。

1.3 流式細胞術檢測CD4+CD25+CD127low/-Treg EDTA 抗凝管采集受試者空腹靜脈血3ml，取100μl全血標本置于流式管中，分別加20μl 抗體，室溫避光孵育15min，加入500μl 溶血素避光孵育10min，加入鞘液2ml，1 500r 離心5min，棄上清，加500μl鞘液重懸細胞后上機。

1.4 real-time PCR 檢測Foxp3 表達情況 Foxp3上游引物：5'-CAG CAC ATT CCC AGA GTT CCT C-3'，下游引物：5'-GCG TGT GAA CCA GTG GTA GAT C-3'。參照說明書進行PCR 操作，反應條件為：94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 60s，共30 個循環(huán)。以GAPDH 為內參，計算相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD4+CD25+CD127low/-Treg 細胞比例 通過流式細胞術檢測外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg細胞的情況，如圖1 所示為一個典型特征結果，以前向散射光FSC 及側向散射光SSC 設門R1 選取淋巴細胞群，去除碎片；在CD4/SSC 圖上顯示R1 內的細胞，選取CD4+細胞設門R2，在CD127/CD25 圖上顯示R2 內的細胞，第二象限UL 為CD4+CD25+CD127low/-Treg 細胞占CD4+細胞比例為7.52%。癌癥患者與正常對照組相比，外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 細胞比例為（5.89±1.74）%顯著高于正常對照組（2.17±0.93）%（t=-16.40，P＜0.05）。且不同分期實驗組Treg 細胞比例也均顯著高于正常對照組（P＜0.05），其中III 期、IV 期癌癥患者Treg 細胞比例顯著高于I～II 期患者（P＜0.05），III 期和IV 期癌癥患者Treg 細胞比例差異無統(tǒng)計學意義（P=0.26）。見表1。

圖1 流式細胞術檢測CD4+CD25+CD127low/-Treg

表1 各組外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg/CD4+T細胞比例（%）

2.2 外周血中Foxp3 表達情況 癌癥患者與正常對照組相比，外周血中Foxp3 相對表達量為（2.65±0.92）%顯著高于正常對照組（1.57±0.47）%（t=-9.06，P＜0.05），且不同分期實驗組Foxp3 相對表達量也均顯著高于正常對照組（P＜0.05），其中IV 期癌癥患者外周血中Foxp3 表達顯著高于I～II 期、III期患者（P＜0.05），I～II 期和III 期癌癥患者外周血中Foxp3 表達無顯著差異（P=0.06）。見表2。

表2 各組外周血中Foxp3 表達情況

3 討論

在腫瘤入侵的最初階段，機體免疫系統(tǒng)可以通過免疫細胞及多種機制清除大多數(shù)腫瘤細胞，使機體免疫處于平衡狀態(tài)；在適應免疫系統(tǒng)后，腫瘤細胞通過變異突破免疫系統(tǒng)的限制，逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。腫瘤發(fā)生免疫逃逸的能力是腫瘤發(fā)生最相關的基本特征之一。

免疫細胞主要包括固有免疫細胞和適應性免疫細胞，而T 淋巴細胞與B 淋巴細胞即為適應性免疫細胞。T 細胞中的Treg 細胞可以抑制免疫、控制自身免疫反應，在腫瘤微環(huán)境中大量存在。Treg 細胞可以通過多種機制抑制T 細胞的活化和增殖。如Treg 細胞可以抑制APC 表面的MHC 分子和共刺激分子（CD80 和CD86），從而減弱APC 向T 細胞的抗原提呈作用；Treg 細胞可以分泌抑制性細胞因子（如TGF-β、IL-10、IL-35）并消耗γc 細胞因子，達到抑制T 細胞的活化和增殖的作用；Treg 細胞分泌穿孔素和顆粒酶對T 細胞和APC 進行殺傷等[4]。

Treg 細胞免疫表型為CD4+CD25+CD127low/-，通過多種機制參與腫瘤免疫調控，在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負向調節(jié)作用，降低了機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和免疫攻擊能力，深入研究調節(jié)性T 細胞和腫瘤免疫之間的關系有助于進一步揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展及遷移機制[5]。Foxp3 是Treg 的特異性核轉錄因子，對Treg 發(fā)育和功能維持起著重要的調節(jié)作用。Foxp3 基因突變會導致Treg 發(fā)育和功能受損，發(fā)生免疫調節(jié)紊亂[6]。CD127 在具有免疫抑制作用的Treg 細胞中低表達，在混合淋巴細胞培養(yǎng)中可抑制同源激活T 細胞的能力，并在相同刺激下無自身作用[7]。Frederick 等[8]研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+CD127low/-Treg 細胞在乳腺癌患者的腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著作用。Erin 等[9]認為Treg 細胞對肺癌患者腫瘤微環(huán)境有影響，可抑制CD8+細胞的抗腫瘤能力，并且與環(huán)氧化物酶COX2 共同增強腫瘤的血管再生能力及侵襲能力。韓麗芳等[10]研究了肝細胞癌組織浸潤Foxp3+調節(jié)性T 細胞與腫瘤免疫的關系，發(fā)現(xiàn)Foxp3+調節(jié)性T 細胞通過抑制CD8+T 細胞增殖，分泌免疫抑制細胞因子IL-10 抑制肝癌的局部免疫，可能導致腫瘤細胞增殖。

本研究對78 例不同癌癥患者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg 細胞及Foxp3 表達水平的分析證實，Treg 細胞可以較好的評價癌癥患者免疫狀況。不同癌癥患者者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg 細胞比例均顯著高于健康人群，與國內外研究結果基本一致[11～14]。同時可以看出，不同分期癌癥患者Treg 細胞比例有所差異，提示腫瘤疾病的發(fā)展與免疫水平的降低有相關性。正常細胞發(fā)生惡性突變后，進一步誘導Treg 細胞增多，而Treg 細胞又在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用，這種協(xié)同作用可能會導致癌癥進一步進展。因此，通過檢測外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 細胞的數(shù)量可更好地評價患者的免疫情況，為癌癥的診斷與治療提供科學臨床依據(jù)。