手術對非小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞的影響

郭繼華 楊鯤鵬 張進 葛曉晴 侯露

肺癌為世界上發病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，按組織學分類，可將其分為小細胞肺癌與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中非小細胞肺癌占肺癌的80%～85%[1，2]。20世紀80年代Ashworth 提出循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）概念[3]，即存在于外周血液循環中的腫瘤細胞。NSCLC 患者的首要治療手段是手術治療。有研究表明，手術治療可引起術后一過性CTC含量增加[4]，還有研究表明手術治療不會引起CTC含量增加，而是出現CTC 含量顯著性下降[5]。本研究通過檢測NSCLC 患者的CTC 情況，探討CTC 檢測在NSCLC 患者治療中的意義，明確手術治療對CTC 的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月～2019年1月我院胸外科收治的NSCLC 患者58 例，男33 例，女25 例，年齡28～78 歲，平均（59.5±9.2）歲。根據國際抗癌聯盟發布的第八版肺癌TNM 分期，分為Ⅰ期24 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期15 例，Ⅳ期5 例。所有NSCLC 患者均行手術治療，術中均行常規系統淋巴結清掃。納入標準：①已行手術治療，術后病理確診為NSCLC；②未合并其他惡性腫瘤；③臨床資料完整。排除標準：①術后病理明確診斷為非NSCLC；②臨床資料不夠完整；③患者拒絕檢測CTC。

1.2 檢測系統及試劑 CTC 檢測采用Cell Search 自動檢測系統[強生（上海）醫療器械有限公司]完成，其中包括 CellTracks AutoPrep 自動分析系統、Celltracks Analyzer Ⅱ自動分析儀和配套的儲存管、試劑盒等。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 于空腹狀態下抽取患者靜脈血7.5ml，置入系統專用CellSave 抗凝儲存管內，抽取時間為手術前1d、手術后1d、手術后7d、手術后30d，樣品于96h 內送檢。

1.3.2 CTC 檢測 將送檢血液標本加入6.5ml 緩沖液充分混勻后以800g 離心10min，將處理后的血液樣本送入CellTracks AutoPrep 自動分析系統內進行細胞富集與分離，然后使用MagNest 磁孵育裝置，再通過4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、抗CK-藻紅蛋白（PE）、抗CD45-別藻藍蛋白（APC）組成的熒光試劑將其染色，結果由Celltracks Analyzer Ⅱ自動分析儀分析完畢后，由兩名工作人員獨立進行計數。CK+/DAPI+/CD45-即為CTC 細胞。

1.4 觀察指標 ①CTC 陽性率（CTC＞0/7.5ml 為陽性，CTC=0/7.5ml 為陰性）；②患者一般情況，性別、年齡、腫瘤病史等；③腫瘤病理情況，腫瘤類型、腫瘤分期。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料中不符合正態分布的數據，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗，以中位數及四分位間距表示，符合正態分布的數據組間比較采用t檢驗，以均數±標準差（±s）表示。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同性別、年齡、病理類型、手術方式患者CTC數值對比 術后1d，年齡≥60 歲患者的CTC 細胞數值高于年齡＜60 歲患者，差異存在統計學意義（P＜0.05），見表1。胸腔鏡手術患者術前CTC 細胞數值低于開胸手術組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。男性與女性患者在各時間點的CTC 細胞數值差異均無統計學意義（P＞0.05）。腺癌與鱗癌患者在各時間點的CTC 細胞數值差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 不同性別、年齡患者CTC 數值對比

表2 不同病理類型、手術方式患者CTC 數值對比

2.2 不同病理分期患者術前、術后1d CTC 陽性率比較 病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者術前、術后1d CTC 陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中Ⅰ期患者術前及術后1d CTC 陽性率均低于其他各期患者，差異有統計學意義（P＜0.05），其余各期術前及術后1d 兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 不同病理分期患者術前、術后1d CTC陽性率比較[n（%）]

2.3 不同時間患者CTC 數值比較 患者術后1d CTC 細胞數值較術前出現一過性上升[12（6.75，15） vs 8（5，12），Z=2.970，P=0.003]，差異有統計學意義。患者術后7d CTC 細胞數值較術后1d呈現下降趨勢[9（4.75，13） vs 12（6.75，15），Z=2.266，P=0.023]，差異有統計學意義。患者術后30d CTC細胞數值與術后7d 比較[8（3，11） vs 9（4.75，13），Z=1.223，P=0.221]，差異無統計學意義。

3 討論

肺癌為我國最常見的惡性腫瘤之一，據我國國家癌癥中心發布數據顯示5年患病率為1/10 萬，男性中居惡性腫瘤第2 位，女性中居惡性腫瘤第4位[6]，對我國國民健康造成嚴重威脅。手術治療為NSCLC 的主要治療手段，但仍有部分患者接受手術治療后出現術后短期內腫瘤復發情況，說明現有的常規手術治療手段并不能解決所有惡性腫瘤帶來的問題。Ashworth[3]提出循環腫瘤細胞概念，非小細胞肺癌腫瘤侵襲周圍血管后，腫瘤細胞會先粘附在血管基底膜上，當腫瘤細胞逐漸增多時，分泌的蛋白酶也將逐漸增多，隨后突破基底膜屏障進入血液循環，隨著血液循環游走全身，以自我播種的形式形成復發轉移。在NSCLC 患者中，CTC 可在任意階段檢測到，動態的CTC 可以反映患者的預后情況[7]。更有研究表明CTC 細胞數量與患者預后呈負相關[8]。

本研究通過檢測患者術前及術后CTC 細胞數值的動態變化，了解CTC 與手術操作及患者臨床基本情況之間的關系。結果顯示，患者術后1d CTC 細胞數值較術前出現一過性上升，隨后患者術后7d CTC 細胞數值較術后1d 呈下降趨勢，出現此種情況的原因可能由于手術過程中手術器械對腫瘤組織進行牽拉、擠壓等操作，致使CTC 細胞進入血液循環中，且手術創傷短期內會對人體免疫機能產生一定抑制作用，導致機體對外周血CTC 細胞滅活數量減少，從而導致術后CTC 細胞數值上升，之后出現術后外周血CTC 細胞數值下降，可能是由于機體內免疫機能于術后創傷后恢復，且外周血CTC 細胞來源—原腫瘤組織被去除，使術后外周血CTC 細胞數值再次出現下降，而不同手術方式患者之間并無明顯差異，林赟等[9]研究也得出了術后CTC 數值較術前出現一過性上升的結論。所以手術操作應精細化，避免不必要的操作，減少對腫瘤組織的牽拉。同時，病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者間術前、術后1d CTC 陽性率比較存在差異。其中Ⅰ期患者術前及術后1d CTC 陽性率均低于其他各期患者，其余各期患者術前及術后1d 兩兩比較，差異均無統計學意義。我們認為，可能由于Ⅰ期患者未出現區域淋巴結轉移，而其他分期患者均存在區域淋巴結轉移，CTC 細胞可由淋巴組織進入血液循環，從而導致此種差異存在。Chen 等[10]及陳志國等[11]研究也得出了不同病理分期之間CTC 細胞陽性率存在差異的結論。術后1d年齡≥60 歲患者CTC 細胞數值高于年齡＜60 歲患者，提示手術過程中對腫瘤組織的牽拉、擠壓等操作對老年群體影響更大，可能由于老年人免疫功能有一定程度的下降，而且手術創傷短期內對免疫功能有一定程度的抑制作用，從而導致機體對外周血CTC 細胞滅活數量減少，外周血CTC 檢測細胞數增多。胸腔鏡手術患者術前CTC 細胞數值低于開胸手術患者，出現這種差異可能是由于分期晚的患者，術前評估手術情況較為復雜，多數行開胸手術，分期早的患者多數為胸腔鏡下手術，而分期為Ⅰ期患者術前CTC 陽性率低于其余各分期患者，進而導致此種差異產生。

綜上所述，手術可導致NSCLC 患者外周血CTC 細胞出現一過性上升，隨后出現下降。術前CTC 與手術方式及病理分期有關，術后1d CTC 與年齡及病理分期有關。