銅綠假單胞菌新西蘭兔膿胸模型的建立

張真強 李金壟 韋球 廖金玲 覃雅婷 鄧鴻媚 梁斌 張士卿 孔晉亮 王可

病菌侵入胸膜腔，產生膿性滲出液積聚于胸膜腔內的化膿性感染，稱為膿胸。膿胸患者的胸腔引流液為膿性液體。有報道稱膿胸的發生多由肺部感染蔓延至胸膜腔所致。除此之外，胸腔穿刺置管引流也是膿胸形成的一部分原因[1]。銅綠假單胞菌是院內感染的常見原因，包括燒傷傷口感染、尿路感染、菌血癥及醫院獲得性肺炎[2]。銅綠假單胞菌是常見的革蘭陰性桿菌，它擁有廣泛的代謝多樣性，這讓它能夠在許多環境和營養條件下繁殖，也使得它能成為一種機會致病菌[3]。膿胸可因各種病原體感染累及胸膜腔而形成。常見的病原體有鏈球菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌；也有銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等革蘭陰性菌；還可有厭氧菌及兼性厭氧菌，甚至是多種微生物的混合感染[1]。本研究通過銅綠假單胞菌建立新西蘭兔膿胸模型，為進一步研究銅綠假單胞菌在胸腔環境中的生長特性、耐藥機制及相應的治療策略提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性新西蘭兔24 只，體重（2.5±0.5）kg，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。飼養條件：室溫，空氣流通，動物自由攝食飲水，隨機分為實驗組及對照組。實驗組16 只，對照組 8 只。

1.1.2 菌株 本實驗所用銅綠假單胞菌標準菌株PAO1 由新加坡南洋理工大學生命科學研究院惠贈。1.1.3 主要試劑及儀器 LB 瓊脂粉、LB 肉湯（北京陸橋公司），戊巴比妥鈉（SIGMA），HE 染色試劑盒（索萊寶），一次性輸液用頭皮針管（湖南康利萊醫療器械有限公司），超凈臺（蘇州凈化），生物安全柜（蘇凈安泰BHC-1300IIA2），分光光度計（普析通用T6），生化培養箱（恒宇SPX-300-II），冷凍離心機（HERMLE Z326K），超低溫冰箱（Thermo 995），多功能酶標儀（Thermo Fisher3020），漩渦振蕩器。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備 本研究使用的銅綠假單胞菌標準菌株PAO1/實驗菌株儲存于含15%甘油的LB肉湯培養基-80℃，接種至LB 瓊脂培養皿中，培養18～24h，然后挑取單個菌落接種于LB 肉湯液體培養基中，37℃搖床培養過夜（14～16h），離心，4℃，3 000rpm，15min，沉淀物使用PBS 緩沖溶液洗滌2 次，用LB 肉湯稀釋至OD600=0.1（菌量為107～108CFU/ml），稀釋成105～106CFU/ml 的細菌懸浮液備用，使用菌落計數法驗證菌液濃度。

1.2.2 實驗分組及新西蘭兔膿胸模型的建立 于廣西醫科大學動物實驗中心清潔級實驗室，將24 只新西蘭兔隨機分成對照組和實驗組，對照組8 只，實驗組16 只。均通過耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉新西蘭兔，固定，右側胸壁第6 肋間定位，消毒，無菌條件下進行穿刺，置入剪除針頭的6 號滅菌一次性輸液針管，實驗組注入新西蘭兔2ml/kg 的105～106CFU/ml 上述菌液，對照組注入2ml/kg LB 肉湯培養液，各組均用1ml 無菌生理鹽水沖洗管壁，以將管壁內浮游菌排入胸腔。將輸液針管剪除頭端置入胸腔內作為載體（導管長度13cm），縫合穿刺部位皮膚。

1.2.3 新西蘭兔膿胸模型胸膜組織病理檢查 取新西蘭兔右側胸腔壁層胸膜組織（胸壁及膈面胸膜）、臟層胸膜組織（肺組織），于10%甲醛溶液中固定24h，制作常規石蠟切片，HE 染色，光學顯微鏡下觀察胸膜厚度及炎癥細胞浸潤情況。

1.2.4 新西蘭兔胸腔積液/膿絮狀物革蘭染色 解剖時，無菌操作下打開新西蘭兔胸腔，取胸腔積液/膿絮狀物保存于滅菌離心管中，無菌操作下取少量胸腔積液/膿絮狀物涂布于載玻片，過火固定。將玻片進行革蘭染色，油鏡下觀察。

1.2.5 新西蘭兔膿胸模型胸腔留置管的細菌培養 經消毒鋪巾，使用滅菌器械剪開新西蘭兔右側胸壁，取出胸腔內留置導管，每個樣本取管3cm 剪碎，收集至無菌試管中，PBS 緩沖溶液沖洗3 次，使用漩渦震蕩儀震蕩10min。取導管浸出液稀釋涂盤，進行活菌計數，結果記作CFU/ml。

2 結果

2.1 膿胸模型評估 共有22 只新西蘭兔存活并完成實驗，對照組無死亡，實驗組意外死亡2 只。術后第4 天解剖新西蘭兔，實驗組新西蘭兔胸腔中可見不等量的胸腔積液或膿絮狀物，胸膜表面粗糙；對照組胸腔內無明顯胸腔積液及膿絮狀物及粘連，胸膜表面光滑，見圖1。膿胸模型成功標準：新西蘭兔胸腔中可見胸膜產生粘連，胸腔中形成膿液或膿絮狀物，胸膜病理學檢查可見大量炎癥細胞浸潤，胸腔積液/膿絮狀物革蘭染色可見革蘭陰性桿菌，即證明膿胸模型建立成功。

圖1 新西蘭兔胸腔大體觀

2.2 胸膜組織的病理檢查 相比于對照組，實驗組新西蘭兔胸膜明顯增厚，胸膜中白細胞滲出增多，見圖2。

圖2 新西蘭兔壁層胸膜組織HE 染色

2.3 胸腔積液/膿絮狀物的革蘭染色 對照組胸腔內無明顯胸腔積液或膿絮狀物形成，實驗組胸腔積液/膿絮狀物涂片革蘭染色，鏡下可見革蘭陰性桿菌分布，見圖3。

圖3 實驗組新西蘭兔胸腔積液/膿絮狀物革蘭染色

2.4 胸腔留置導管的菌落計數 對照組新西蘭兔胸腔留置導管未培養出細菌；實驗組胸腔留置導管培養出銅綠假單胞菌菌落，菌量為（6.020±0.438）log（CFU/ml）。

3 討論

實驗動物的膿胸模型在近年的一些研究中偶有提及，包括金黃色葡萄球菌膿胸模型、肺炎鏈球菌膿胸模型等。早期學者實驗證明了直接向動物胸腔中注入細菌并不能成功建立模型，結果是實驗動物死于敗血癥或者胸腔內的細菌被完全清除[4]。近年來，大多研究者選擇向胸腔內注入松節油誘發無菌性胸膜炎，產生滲出液以為細菌提供營養等生長條件，再向胸腔中注入細菌以誘導膿胸的發生[5]。亦有研究成功使用腦心浸液培養的肺炎鏈球菌注入大鼠胸腔以建立膿胸模型[6]。與其他研究不同的是，本研究一方面在未使用松節油刺激胸膜的前提下使用LB肉湯作為銅綠假單胞菌懸液的溶劑，將細菌注入胸腔，并留置導管，成功制造了新西蘭兔的銅綠假單胞菌膿胸模型；另一方面，對留置于胸腔中的導管進行分析，這是其他動物膿胸模型研究中所未提及的。同時使用LB 肉湯單獨注入新西蘭兔胸腔作為對照組，最終發現對照組新西蘭兔膿胸中LB 肉湯被完全吸收，胸腔內無明顯粘連，且無膿絮狀物及胸腔積液產生，證明膿胸的發生的確是由銅綠假單胞菌在胸腔內感染形成。

在臨床中，胸腔閉式引流是常用的膿胸治療手段之一[7，8]，胸腔引流有利于排出胸腔內膿液，以減少肺組織所受積液壓迫，促進肺復張及功能的恢復。同時，對于胸腔內存在粘連及分隔的患者，通過引流管向胸腔內注入纖維蛋白溶解藥物也是常用的治療方法。然而，閉式引流的引流管上是否會有細菌粘附及生長，也是個不容忽視的問題。引流管的留置是否會加重細菌在胸腔內的感染，導致膿胸遷延不愈，值得思考。首先，引流管是否對胸膜造成異物刺激，進而加重胸膜的炎性滲出，為細菌的生長提供營養條件；其次，引流管的表面可能更適宜細菌聚集及粘附生長，而為細菌提供了生長環境及庇護所。本研究發現，埋入胸腔內的引流管，經過沖洗后，震蕩所得的懸浮液中可培養出大量銅綠假單胞菌，證明了引流管上也有細菌粘附生長。生長在引流管上的細菌是否持續向胸腔中釋放，而導致膿胸遷延不愈，仍有待研究。

本課題組將在后續的研究中繼續改進膿胸模型，并使用該模型研究膿胸發生的影響因素，如胸腔中pH 值，菌株種類及進一步的藥物干預試驗。

總之，本研究通過胸腔穿刺置管向新西蘭兔胸腔中注入銅綠假單胞菌，且置入引流管，建立了新的銅綠假單胞菌新西蘭兔膿胸模型，并發現了引流管上有大量細菌生長。使用該膿胸模型，可進一步研究銅綠假單胞菌膿胸的發生機制及影響膿胸形成的理化因素，為進一步研究膿胸的治療提供了實驗基礎和理論依據。