HPV16型感染者 宮頸組織p16、Ki-67表達(dá)及早期干預(yù)的對比研究

王春蘭，陸 燕，仲玉英，季月霞，金麗芳

（江蘇省常熟市中醫(yī)院/海峽兩岸精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)HPV感染疾病專業(yè)委員會(huì)， 1.婦產(chǎn)科；2.病理科，江蘇 常熟 215500）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤。隨著我國宮頸癌早診早治工作大面積的開展，許多宮頸癌在癌前病變階段被發(fā)現(xiàn)，如何正確精準(zhǔn)診斷和管理宮頸癌前病變正日益受到婦產(chǎn)科醫(yī)師的廣泛關(guān)注。宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia， CIN）的形成都與高危型HPV感染密切相關(guān)，尤其是高危HPV16型感染，其致宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)排名第一，值得我們重視[1-4]。宮頸上皮內(nèi)瘤變作為宮頸癌的癌前病變，如能得到及時(shí)的治療可阻斷宮頸癌的發(fā)生。目前，由于我國各地區(qū)經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療發(fā)展水平不平衡，導(dǎo)致CIN的診斷和治療仍存在著許多問題，其中較為突出的是CIN的治療比較混亂，存在著CIN過度治療等問題。因此，正確判斷CIN病變進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，尋找CIN進(jìn)展的影響因子和標(biāo)志物，構(gòu)建CIN的干預(yù)治療的預(yù)警模式，并根據(jù)CIN不同階段的特點(diǎn)，結(jié)合患者的年齡以及生育要求，選擇更加合理的個(gè)體化觀察方式和治療方案，越來越受到國內(nèi)外臨床醫(yī)師的廣泛重視[5-7]。本文對122例高危HPV16型感染者，依據(jù)p16、Ki-67蛋白檢測不同的表達(dá)情況給予觀察和早期干預(yù)治療。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月～2017年5月江蘇省常熟市中醫(yī)院婦科門診及住院患者中宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常及人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）分型檢測為高危HPV16型感染者122例作為研究對象。年齡20～68歲，平均年齡（42.2±10.8）歲，按宮頸組織p16、Ki-67蛋白的表達(dá)有無將其分為無表達(dá)組（A組）48例及表達(dá)組（B組37例和C組37例）74例，各組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

（1）人乳頭狀瘤病毒（HPV）基因分型檢測試劑盒（中國專利號(hào)：02102795.1，廣東凱普生物科技有限公司）以快速雜交儀，檢測結(jié)果：高危HPV 16型陽性。免疫組化試劑：采用P16/MTS1（產(chǎn)品編號(hào)：MAB-0223，克隆號(hào)：6H12，規(guī)格6ml），Ki-67（產(chǎn)品編號(hào)：RMA-0542，克隆號(hào)：SP6，規(guī)格6ml）均購置福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

（2）宮頸組織病理活檢取樣：采用窺陰器充分暴露宮頸，用棉拭子擦去宮頸口過多的分泌物，用醋酸棉球順時(shí)針涂宮頸口兩圈，稍等數(shù)分鐘，觀察宮頸，如為醋酸白試驗(yàn)陰性，按3、6、9、12點(diǎn)四點(diǎn)組織取樣，如為醋酸白試驗(yàn)陽性，除3、6、9、12點(diǎn)四點(diǎn)組織取樣外，再加上醋酸白試驗(yàn)陽性點(diǎn)組織取樣。

（3）宮頸組織活檢病理診斷：①正常或炎癥；② CIN，按宮頸病變的輕中重分為CINI級(jí)、CINII級(jí)、CINIII級(jí)；③早期浸潤癌（包括微小浸潤癌）；④浸潤癌。

（4）結(jié)果判定：①高危HPV 16型：每例標(biāo)本檢測結(jié)束后，對每張膜片進(jìn)行閱膜，判斷膜片上藍(lán)色信號(hào)所處基因型編號(hào)的位置，點(diǎn)和號(hào)對應(yīng)，記錄HPV的基因型16號(hào)位置為一藍(lán)色信號(hào)確定單一型HPV16型陽性，所有被選病例均為HPV16型單一型感染者。②免疫組化：p16陽性位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，染色模式顯示為彌漫型（呈棕黃色或棕褐色顆粒或粗顆粒），即宮頸鱗狀上皮基底層和副基底層的細(xì)胞呈現(xiàn)出連續(xù)染色，伴或不伴有表層細(xì)胞著色，判斷p16為（+）；宮頸鱗狀上皮無染色、孤立細(xì)胞或小細(xì)胞群的染色（斑駁狀染色）均判斷為（-）。Ki-67陽性位于細(xì)胞核（呈棕黃色），宮頸鱗狀上皮層除基底層和基底旁層外的細(xì)胞核染色，判斷Ki-67為（+），無染色判斷為（-）。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）陰道分泌物異常增多、異味、瘙癢或夾血絲；（2）HPV16型感染者，年齡＞20歲，有性行為二年以上，均無子宮切除術(shù)、宮頸手術(shù)史、當(dāng)前未懷孕；（3）能配合完成陰道鏡檢查及活檢，有關(guān)病史的采集；（4）知情同意、能自愿納入采集病例。以上4項(xiàng)均滿足者，才能納入研究，如果以上任何一項(xiàng)回答“否”，則不納入研究。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）無性生活史、妊娠期或哺乳期女性；（2）陰道鏡活檢常規(guī)病理提示：無宮頸上皮內(nèi)瘤變（≥CIN I）；（3）排除非生殖系統(tǒng)惡性腫瘤患者；（4）合并有肝腎、腦血管、心血管和造血障礙等原發(fā)性疾病者；（5）精神病患者；（6）非單一HPV16型感染者或HPV16型伴一種以上型別感染者；如果以上任何一項(xiàng)回答“是”，則該患者將不被納入研究范疇。

1.5 研究方法

入組病例為高危HPV 16型感染者均采用陰道鏡和宮頸組織活檢，陰道鏡活檢常規(guī)病理提示：無宮頸上皮內(nèi)瘤變（≥CIN I），同時(shí)對宮頸組織行免疫組化p16、Ki-67蛋白檢測，依據(jù)p16、Ki-67蛋白的表達(dá)情況分為無表達(dá)組（A組）及有表達(dá)組（B組和C組），宮頸活檢組織p16、Ki-67蛋白無表達(dá)組觀察一年，再行宮頸HPV分型檢測+活檢。宮頸活檢組織p16、Ki-67蛋白表達(dá)者分二組，一組為藥物（使用重組人干擾素α-2b栓：陰道塞藥，每例感染者每月連續(xù)用10天，用三個(gè)月）治療組（B組），一組為LEEP術(shù)治療組（C組），p16、Ki-67蛋白表達(dá)治療組一年后再復(fù)查HPV型別+活檢。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n）、百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組高危HPV16型轉(zhuǎn)陰率比較

A 組轉(zhuǎn)陰率最低，C 組轉(zhuǎn)陰率最高，三組之間高危H P V 1 6 型轉(zhuǎn)陰率兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組高危HPV16型轉(zhuǎn)陰率比較

2.2 一年后各組CIN病變發(fā)生率比較

p16、Ki-67蛋白無表達(dá)的觀察組（A組）一年后發(fā)展為CIN病變者共18例，其中CIN I級(jí)病變13例，占72.22%，CIN II級(jí)病變4例，占22.22%，CIN III級(jí)病變1例，占5.56%，總的CIN病變發(fā)生率為37.50%；p16、Ki-67蛋白表達(dá)組（B組）發(fā)展為CIN病變者共9例，其中CIN I級(jí)病變7例，占77.78%，CIN II級(jí)病變1例，占11.11%，CIN III級(jí)病變1例，占11.11%，總的CIN發(fā)生率為24.32%；p16、Ki-67蛋白表達(dá)組（C組）無發(fā)展為CIN病變者，總的CIN病變發(fā)生率為0。見表2。

表2 各組CIN病變發(fā)生率比較

3 討 論

近十多年來，我國女性宮頸癌的發(fā)病呈現(xiàn)出兩大特點(diǎn)：一是發(fā)病人數(shù)仍在上升，二是發(fā)病年齡年輕化，其發(fā)病率每年仍以2%～3%的速度增加。宮頸癌是目前人類所有惡性腫瘤中病因?qū)W最明確的腫瘤，高危型HPV持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。高危型HPV有數(shù)十種之多，各個(gè)型別之間致癌力存在著明顯的差異性，其中高危HPV16型致癌性最強(qiáng)，同時(shí)宮頸癌也存在著一個(gè)較長的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）期，這就給臨床婦產(chǎn)科醫(yī)師留下了充足的干預(yù)治療時(shí)間[4，8]。因此，臨床上高危型HPV分型檢測和預(yù)測CIN病變的進(jìn)展已受到了前所未有的重視。單獨(dú)將高危型HPV作為一線檢測手段存在著一些缺陷，從而對高危型HPV預(yù)測CIN進(jìn)展的價(jià)值產(chǎn)生一定的影響。p16的表達(dá)主要與宮頸癌前病變（即CIN病變）程度有關(guān)，可作為高危型HPV感染陰性的宮頸鱗狀細(xì)胞癌及癌前病變的診斷指標(biāo)[9]。如能將高危型HPV分型檢測和p16和Ki-67蛋白檢測組合應(yīng)用，對臨床醫(yī)師判斷宮頸病變的進(jìn)展和風(fēng)險(xiǎn)，適時(shí)采取干預(yù)治療有著重要的指導(dǎo)意義。

p16為一種抑癌基因，其p16基因編碼的蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白D依賴性激酶的抑制劑，當(dāng)宮頸細(xì)胞被高危型HPV感染后，高危型HPV的E7蛋白競爭性抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）與視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的結(jié)合，使得Rb失去活性，同時(shí)激活了轉(zhuǎn)錄因子E2F，使其基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，從而導(dǎo)致p16蛋白過度表達(dá)，可檢測到p16蛋白。Ki-67為一種細(xì)胞增殖核抗原，Ki-67蛋白表達(dá)的水平提示細(xì)胞的增殖狀態(tài)。p16已成為一種宮頸早期惡性病變的指標(biāo)，能夠在早期有效地判斷宮頸病變走向，并采取積極治療措施，對遏制宮頸癌前病變的進(jìn)展，促進(jìn)腫瘤治療均有顯著優(yōu)勢。Ki-67是一個(gè)判斷腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移情況的標(biāo)志物，對腫瘤增殖、浸潤的評(píng)估價(jià)值較高[7，9]。高危型HPV感染與p16和 Ki-67表達(dá)之間存在著相關(guān)性和互補(bǔ)性，三者共同檢測的價(jià)值更高。

本研究高危HPV16型感染者一年后轉(zhuǎn)陰率比較：A組（p16、Ki-67蛋白無表達(dá)，觀察組）一年后高危HPV16型轉(zhuǎn)陰率為37.50%，B組（p16、Ki-67蛋白有表達(dá)，藥物治療組）一年后高危HPV16型轉(zhuǎn)陰率為45.95%，C組（p16、Ki-67蛋白有表達(dá)，LEEP術(shù)治療組）一年后高危HPV16型轉(zhuǎn)陰率為89.90%，觀察組HPV16型感染者轉(zhuǎn)陰率最低，低于藥物治療組和LEEP術(shù)治療組，三組高危HPV16型轉(zhuǎn)陰率之間對比均有顯著差異性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示高危HPV16型感染可增加發(fā)生高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤樣病變及宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)，所以高危型HPV16感染的婦女應(yīng)結(jié)合p16、Ki-67檢測結(jié)果進(jìn)行干預(yù)治療，干預(yù)治療比不干預(yù)治療，高危HPV16型一年后轉(zhuǎn)陰率要高，以LEEP術(shù)干預(yù)治療，高危HPV16型轉(zhuǎn)陰率效果最好。

高危HPV16型感染者一年后三組CIN病變發(fā)生率的比較：A組（p16、Ki-67蛋白無表達(dá)，觀察組）觀察一年后發(fā)展為CIN病變者共18例，其中CIN I級(jí)病變者13例，占72.22%（13/18），CIN II級(jí)病變者4例，占22.22%（4/18），CIN III級(jí)病變者1例，占5.56%（1/18），總的CIN病變發(fā)生率為37.50%（18/48）；B組（p16、Ki-67蛋白有表達(dá)，藥物治療組）一年后發(fā)展為CIN病變者共9例，其中CIN I級(jí)病變者7例，占77.78%（7/9），CIN II級(jí)病變者1例，占11.11%（1/9），CIN III級(jí)病變者1例，占11.11%（1/9），總的CIN病變發(fā)生率為24.32%（9/37）；C組（p16、Ki-67蛋白有表達(dá)，LEEP術(shù)治療組）一年后無發(fā)展為CIN級(jí)病變者，總的CIN發(fā)生率為0.00%（0/37）。觀察組中高危HPV16型感染者總的CIN病變發(fā)生率最高，高于藥物治療組和LEEP術(shù)治療組，三組高危HPV16型感染者之間總的CIN病變發(fā)生率對比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示高危HPV16型感染者通過干預(yù)治療，宮頸CIN II級(jí)以上病變的發(fā)生率明顯下降。女性宮頸CIN病變與高危型HPV感染有關(guān)，宮頸CIN病變級(jí)別越高，高危型HPV感染率也隨之增高。由于高危型HPV型別很多，其致癌性強(qiáng)弱與高危型HPV型別密切相關(guān)，高危HPV16型致癌性最強(qiáng)。高危HPV16型感染宮頸后會(huì)增加發(fā)生CIN II級(jí)以上病變及宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)，以至高危HPV16型感染的觀察組出現(xiàn)了CIN II級(jí)和CIN III級(jí)病變患者，應(yīng)引起臨床醫(yī)師的高度關(guān)注。對高危HPV16型感染的CIN II級(jí)以上病變經(jīng)過治療后的患者更應(yīng)予以密切的隨訪，HPV的基因型檢測應(yīng)被視為治療后隨訪的重要指標(biāo)。間隔時(shí)間至少6個(gè)月行HPV分型檢測。同時(shí)配合細(xì)胞學(xué)檢查及p16、Ki-67蛋白檢測，以便發(fā)現(xiàn)宮頸高級(jí)別病變。

綜上所述，CIN病變的發(fā)生和進(jìn)展與高危型HPV感染密切相關(guān)，高危HPV 16型感染在全球范圍內(nèi)均為最主要的致癌型別，致癌力最強(qiáng)，其檢測率一般超過60%以上[4，10，11]。選擇致癌力最強(qiáng)的高危HPV16型感染者作為研究對象，對其他高危型HPV感染者有著借鑒和參考作用，用p16、Ki-67蛋白檢測對高危HPV16型感染者進(jìn)行分流是選擇早期干預(yù)治療者的一個(gè)重要指標(biāo)，它們可彌補(bǔ)高危HPV檢測敏感性過高和高危HPV檢測陰性造成的缺陷[7-9]。p16、Ki-67蛋白檢測陰性而高危HPV16型感染者，一年內(nèi)可發(fā)生CIN病變患者，其CIN II級(jí)以上病變的發(fā)生率明顯比兩組經(jīng)干預(yù)治療的高危HPV16型感染者要高的多。因此，對這類高危HPV16型感染者，半年后可行高危HPV16型和p16、Ki-67蛋白復(fù)檢，必要時(shí)行宮頸活檢。p16和Ki-67的表達(dá)與宮頸癌前病變的級(jí)別密切相關(guān)已得到公認(rèn)，在高危HPV陰性的高級(jí)別CIN病變中，p16陽性可作為高危HPV感染所致的宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變的替代的標(biāo)志物[9，12]。由于HPV疫苗不能解決宮頸癌預(yù)防所有問題，宮頸癌的早期干預(yù)治療仍然是未來研究的方向，宮頸癌前病變干預(yù)治療的手段和方法仍需要我們在臨床上不斷地探索和總結(jié)，期待著多中心大樣本的深入研究。