法舒地爾對過氧化氫介導的內皮損傷后TGF-β2及IL-8的影響

肖晨雪，周 霞，金元哲，周東暉

冠狀動脈粥樣硬化是一種患病率居高不下的常見病，且至今仍無法徹底的探明其所有的發病因素及機制，而氧化應激與炎癥被認為在其發病過程中扮演著重要角色。過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)引起的活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加引發的氧化應激能夠促進脂質的氧化，使內皮下間隙的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)氧化，進而促進粥樣硬化斑塊形成[1]。炎性介質也是一個不可或缺的因素。白細胞介素8(interleukin 8，IL-8)可以增強白細胞對血管內皮的粘附力，進而引起內皮損傷，誘發動脈粥樣硬化[2]。同時氧化應激損傷能夠增加轉化生長因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)的生成，進而引起心肌細胞損傷[3]。有研究發現在人晶狀體上皮細胞中，糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)誘導的ROS增加能夠促進TGF-β2的生成[4]。

法舒地爾(Fasudil，FH)作為一種新型Rho激酶抑制劑，對于氧化應激與炎性介質有有效的抑制作用。FH可以直接與Rho激酶(Rho-associated protein kinase，ROCK)-CD結合，抑制Rho酶的活性[5]，從而減輕ROS誘導的RhoA-ROCK信號通路的異常激活。周中興等[6]發現FH可以降低球囊損傷后大鼠主動脈血清IL-8的濃度。還有文獻提示FH可以有效減少心肌梗死大鼠非梗死心肌細胞中炎性因子TGF-β2的表達[7]。

但目前在血管內皮細胞中，ROS對TGF-β2及IL-8的影響國內少有報道，本研究通過體外應用H2O2誘導細胞發生氧化應激損傷，建立氧化損傷細胞模型，探究氧化應激對血管內皮細胞炎性因子TGF-β2及IL-8的影響以及FH的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備 細胞株EA.Hy926(廣州吉歐姆公司)；DMEM高糖培養基、PBS緩沖液(HyClone公司，美國)；胎牛血清(Biological Industries公司，以色列)。實驗試劑：兔抗GAPDH一抗、羊抗兔二抗(Santa Cruze公司，墨西哥)；人IL-8酶聯免疫分析試劑盒、人TGF-β2酶聯免疫分析試劑盒(Abcam公司，英國)；BCA試劑盒(北京致力生物科技有限公司)；ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所)；FH(Selleck公司，美國)；超靈敏化學發光底物(Thermo公司，美國)；RIPA裂解液(Thermo公司，美國)；GADPH(中國康為世紀生物公司)；WB曝光儀(型號：Tanon 5200，上海天能科技有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 Hy926細胞用含10%胎牛血清的DEME培養液在37 ℃、5%CO2的培養條件下培養，待細胞融合至70%～80%，用胰酶消化，按1∶2傳代，選3～6代作為實驗用細胞。

1.2.2 氧化損傷模型建立 取對數生長期細胞，按5×104/mL接種于無菌24孔板上，37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h，選取細胞融合80%～90%的孔板以30% H2O2誘導細胞2 h后，顯微鏡下觀察細胞狀態，PBS清洗，換用完全培養液繼續培養細胞[8]。

1.3 實驗分組 選融合至80%～90%的培養瓶細胞，胰酶消化，按1∶4傳代，待傳代細胞生長至70%左右，作為實驗分組用細胞。H2O2組(過氧化氫損傷2 h后換用10%FBS培養基37 ℃、5%CO2培養箱中培養細胞48 h)；FH干預組(PBS清洗2次氧化損傷細胞，更換為75 nmol/L FH+培養基37 ℃、5% CO2培養箱中培養細胞48 h)；單純FH組(無氧化處理，使用75 nmol/L FH+培養基，37 ℃、5%CO2培養箱中培養細胞48 h)；對照組：無處理正常細胞。用倒置相差顯微鏡觀察各組實驗細胞生長狀況。

1.4 觀察細胞的形態及凋亡情況 收集對數生長期的細胞，用含10%胎牛血清RPMI1640培養基將細胞調至2×104/mL，100 μL/孔的量接種于96孔板內，1 mL/孔的量接種于6孔板于37 ℃、5% CO2條件下進行培養。細胞培養12 h后按實驗分組處理。處理后的細胞通過吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)染色30 s，在熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。

1.5 熒光法測ROS以及ELISA法測氧化產物IL-8、TGF-β2及Western Blot法測RhoA、肌球蛋白磷酸酶靶蛋白-1(myosinephosphatae targeting subunit-1，MYPT-1)的含量

1.5.1 裂解液的制備 收集各組細胞，用冰浴后的PBS洗滌，隨后加入RIPA裂解液，低溫高速離心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)，留上清測定蛋白質濃度。

1.5.2 熒光法測ROS 測定孔版加入190 μL各組細胞裂解上清液樣本與1 mmol/L的DCFH-DA 10 μL,對照孔則加入等量細胞裂解上清液樣本與PBS 10 μL，混勻，37 ℃孵育30 min。于485 nm測定其熒光強度，根據公式“ROS量=熒光強度×190÷200”計算ROS的量。

1.5.3 ELISA法測氧化產物IL-8、TGF-β2 取標準品干粉83 ng溶于83 μL雙蒸水中，混勻后取2 μL用雙蒸水配制成2 000 pg/mL的標品備用。在酶標包被孔板上設7個標準孔，按濃度梯度為2 000 pg/mL、1 000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、0 pg/mL稀釋。待測樣品孔中加樣品稀釋液90 μL及培養基上清液樣品10 μL混勻，隨后除空白孔外均加入100 μL酶標試劑?；靹蚝髼壢ヒ后w，甩干后洗滌4次。隨后每孔加入100 μL抗體檢測溶液，室溫孵育2 h。棄上清洗滌4次后每孔加入100 μL稀釋400倍的Streptavidin-hrp溶液，在室溫下孵育30 min。棄上清洗滌4次后加入終止液100 μL，于450 nm波長測定各孔光密度(optical density，OD)值。計算待測樣品濃度：用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程，將待測樣品孔的OD值代入回歸方程，算出待測樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為待測樣品實際濃度。分別測量IL-8、TGF-β2，重復檢測實驗6次。

1.5.4 Western Blot檢測 細胞裂解液經過BCA試劑盒細胞總蛋白經12%SDS-PAGE凝膠電泳分離,然后通過Western Blot轉移到孔徑為0.2 μm的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上。經過4 ℃過夜封閉PVDF膜上非特異結合位點后，用5%脫脂奶粉配制的特異性抗體(一抗)，稀釋度均為(1∶1 000)，室溫封閉PVDF膜2 h,之后用TBS-T洗去未結合的抗體，再用帶有辣根過氧化物酶(HRP)標簽的羊抗兔二抗繼續室溫封閉PVDF膜1 h。然后用TBS-T洗去未結合的二抗，最后用Tanon5200機器曝光。以GAPDH作為內參對照。用GTS圖像分析系統分析Western Blot的目的條帶。以校正值K對所檢測蛋白進行半定量分析。K=樣本條帶吸光度值/GAPDH吸光度值。

2 結果

2.1 FH對細胞形態影響 單純H2O2處理顯著抑制細胞生長，并出現細胞變小，變圓，沒有正常Hy926細胞形態。FH能夠抑制H2O2產生的這種現象，但無法逆轉，圖1。

圖1 顯微鏡下Hy926細胞形態(×160)

2.2 FH對H2O2引發細胞凋亡的影響 AO/EB染色，48 h處理，可見H2O2大量的凋亡細胞出現，而FH干預組細胞雖然也出現了縮小變形，但鏡下凋亡的細胞較H2O2組有所下降，圖2。

圖2 熒光顯微鏡下Hy926細胞調亡情況(×40)

2.3 FH對H2O2引發Hy926細胞產生ROS影響 與對照組比較，H2O2組ROS明顯上升(P<0.01)；與對照組比較，FH干預組ROS明顯上升(P<0.01)；與H2O2組比較，FH干預組ROS下降(P<0.01)，圖3。

與H2O2組比較，*P<0.01；與對照比較，&P<0.01圖3 各組ROS熒光測定結果

2.4 FH對H2O2引發Hy926細胞產生IL-8能力影響 與對照組比較，H2O2組IL-8明顯上升(P<0.01)；與對照組比較，FH干預組IL-8明顯上升(P<0.01)；與H2O2組比較，FH干預組IL-8下降(P<0.01)，圖4。

與H2O2組比較，*P<0.01；與對照比較，&P<0.01圖4 各組IL-8濃度測定結果

2.5 FH對H2O2引發Hy926細胞產生TGF-β2的影響 與對照組比較，H2O2組TGF-β2明顯上升(P<0.01)；與對照組比較，FH干預組TGF-β2明顯上升(P<0.01)；與H2O2組比較，FH干預組TGF-β2下降(P<0.01)，圖5。

與H2O2組比較，*P<0.01；與對照比較，&P<0.01圖5 各組TGF-β2濃度測定結果

2.6 RhoA蛋白表達水平 RhoA蛋白表達水平能夠被H2O2激活，而FH具有抑制H2O2激活RhoA蛋白表達的能力，圖6。

圖6 RhoA蛋白表達水平

2.7 MYPT-1磷酸化水平 H2O2損傷組MYPT-1磷酸化較對照組明顯升高，FH干預組的MYPT-1磷酸化水平較H2O2組明顯下降，說明FH能夠抑制H2O2誘導的MYPT-1磷酸化，即抑制RhoA-ROCK信號通路的激活。

圖7 MYPT-1磷酸化水平

3 討論

抑制氧化應激反應對于預防冠狀動脈粥樣硬化至關重要。異常增加的TGF-β2可以激活Rho激酶信號通路，進而加劇冠狀動脈粥樣硬化，IL-8亦可以調節炎性細胞的轉移，從而加劇內皮損傷。本研究通過H2O2誘導Hy926細胞發生氧化損傷，比較FH對于氧化應激后早期炎性因子IL-8以及TGF-β2的影響。

有研究已證實FH可以有效拮抗高糖引起的人腹膜間皮細胞的氧化應激引發的細胞損傷[9]，但該研究未詳細探究相關機制。而另一項研究表明，FH可以通過抑制NF-κB的活性來減弱AGEs引起的細胞凋亡[10]。本研究中FH能拮抗H2O2介導的氧化應激對血管內皮細胞增殖的抑制作用，同時抑制血管內皮細胞凋亡，但無法逆轉。提示FH能夠有效減輕H2O2導致的氧化應激帶來的細胞損傷，可能與FH對NF-κB的抑制作用有一定的關系。但同時在本研究中氧化應激引起的炎性介質TGF-β2及IL-8的異常增加也可能導致細胞的凋亡加速，其具體機制是否與NF-kB有關系尚有待進一步研究。本研究中并未發現FH對正常細胞的增殖有明顯的影響，可能與用藥時間及用藥濃度相關。FH對無異常增殖的血管內皮細胞的影響以及FH對細胞氧化損傷的緩解在其他細胞中是否也有同樣的作用仍有待進一步研究。

IL-8是嗜中性粒細胞的一種主要激活劑，多種炎性疾病被證實與其密切相關[11]。在誘導中性粒細胞向受損細胞聚集這一過程中IL-8起著至關重要的作用[12]。在慢性炎性刺激過程中，IL-8可以增加中性粒細胞在內皮細胞上的粘附能力，并誘導其跨內皮轉移，引發血管功能障礙和血管疾病，包括動脈粥樣硬化、主動脈瘤形成和高血壓[2]。有研究指出，ROCK信號通路的激活可以導致IL-8的表達增加[13]，從而加重內皮損傷。TGF-β2作為TGF超家族中的一員，其可以抑制巨噬細胞的凋亡[14]，而巨噬細胞在早期動脈粥樣硬化斑塊形成的過程中起到了至關重要的作用。血管平滑肌細胞會因巨噬細胞分泌出Fas配體出現加速凋亡，同時平滑肌細胞的凋亡又反向加速了巨噬細胞的凋亡[15]。因此，當TGF-β2過度表達時，巨噬細胞的凋亡下降，進而加速了冠狀動脈粥樣硬化斑塊的進展。有研究表明，當RhoA-ROCK通路被激活時，可觀察到TGF-β2的表達顯著增加[16]，而TGF家族蛋白的增加還可以反過來通過Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子1(ARHGEF1)增強Rho激酶活性[17]，從而進一步加劇內皮損傷。本研究結果發現，當H2O2損傷內皮細胞時，IL-8與TGF-β2的含量顯著增加，而FH則能夠抵抗這種效應，也許與FH對Rho激酶的抑制作用有關。FH對于炎性介質的影響究竟是影響其合成還是在釋放的途徑有阻斷，仍需進一步證實。

MYPT1是平滑肌細胞內肌球蛋白輕鏈磷酸化酶(myosin light-chain phosphase,MLCP)的一個亞基，而ROCK是一種小G蛋白RhoA的下游效應器。當ROCK被激活時，MYPT1就會發生磷酸化，進而引起MLCP失活、胞內磷酸化肌球蛋白輕鏈(p-MLC)水平增高[18]，引起血管平滑肌細胞功能障礙。因此MYPT1是ROCK信號通路激活的一個標志。還有研究表明ROS亦可以通過ARHGEF1激活RhoA蛋白活性[19]，進而激活RhoA-ROCK信號通路，引起大鼠肺動脈收縮。本研究中我們通過MYPT-1的磷酸化程度增加，證實了ROCK信號通路確實被激活。且FH作為一種Rho激酶抑制劑，可以有效抑制氧化應激損傷后導致的細胞凋亡以及炎性介質TGF-β2與IL-8的增加，其機制可能與FH對ROCK信號通路的抑制作用有關，且單純的FH對于細胞的損傷并不明顯。但ROCK的激活是否與ARHGEF1有關聯，以及其中具體分子機制有待進一步研究。氧化應激損傷的機制紛繁復雜，本研究僅驗證了RhoA-ROCK單一信號通路，FH對氧化應激損傷的抑制作用是否僅有這一種機制本研究尚未證實，其他信號通路是否受影響仍有待進一步研究。且當損傷加劇，FH的作用是否仍然有效尚需更深入的研究。

綜上，FH能有效的通過抑制RhoA-ROCK信號通路來減輕H2O2誘導的內皮細胞損傷，這對冠心病等其他心血管疾病的治療與預防有一定的指導作用。但本研究僅檢測了TGF-β2與IL-8這兩個產物，而FH對于氧化應激的抑制的更詳細的分子機制以及FH對內皮細胞的保護作用還有待進一步研究。