用gap基因和MALDI-TOF MS技術對臨床常見凝固酶陰性葡萄球菌快速分子鑒定

翟 鑫，馮柏娥，張雪靜，劉朝軍

凝固酶陰性葡萄球菌(coagulasenegativestaphylococcus，CNS)屬于革蘭陽性葡萄球菌，通常被認為人體正常菌群，但隨著廣譜抗生素廣泛使用，各種插管和支架患者的增多,化療、放療、激素和免疫抑制劑的大量使用，以及惡性腫瘤治療等因素導致機體免疫功能下降，臨床感染率逐漸增高，已經成為臨床院內感染最重要的潛在病原菌[1]。

目前對于CNS的鑒定，主要通過表型鑒定，通過分析病原菌的生化反應特性區分，如VITEK2 GP和BD試劑盒，對于一些不典型菌株和少見菌株，該系統往往無法加以準確區分[2]。而一些基于PCR擴增的分子學方法已得到廣泛應用，目前微生物分子鑒定主要通過16S rDNA基因方法，研究顯示這些基因方法要明顯優于表型方法[3]，但在區分CNS具體種屬上，GenBank基因庫比對往往會出現基因相似率過高的情況。有研究表明gap基因能夠準確的鑒定CNS,gap基因是一種編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的轉錄蛋白，存在于葡萄球菌細胞壁中，可以用于CNS的快速分子鑒定[4]。本研究收集臨床常見CNS，采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)蛋白質質譜鑒定方法進行鑒定，并與gap基因鑒定進行比較，以便建立對CNS的快速分子鑒定，為臨床提供快速和準確診斷。

1 材料與方法

1.1 菌種來源 收集中國人民解放軍總醫院第六醫學中心2016年1月—2017年12月臨床分離的CNS,分別為腐生葡萄球菌、路鄧葡萄球菌、人葡萄球菌、人葡萄球菌人亞種、產色葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、雞葡萄球菌、溶血葡萄球菌、木糖葡萄球菌、科氏葡萄球菌解脲亞種、沃氏葡萄球菌、中間葡萄球菌、解糖葡萄球菌、緩慢葡萄球菌和松鼠葡萄球菌。標準菌株為表皮葡萄球菌ATCC12228，實驗菌株經過表型方法API20 Staph和VITEK2 GP確認鑒定。

1.2 DNA提取 采用煮沸裂解法，提取目的DNA[4]。

1.3 PCR擴增 Gap基因上游序列5′-ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA-3′，下游序列5′-GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG-3′，擴增片段大小931 bp[5]。反應體系50 μL：10×Buffer(包含MgCl2)5.0 μL,dNTPS(2.5 mol/L)4 μL，Primer(10 μmol/L混合)2 μL，Tag酶0.25 μL(日本TaKaRa公司)，雙蒸水30 μL，DNA模板8 μL。擴增條件：94 ℃加熱2 min后，40個循環：95 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s,72 ℃延伸5 min，擴增產物通過凝膠電泳獲取目的條帶，留取擴增產物進行測序。

1.4 生物信息分析 獲得的gap基因原始序列，在GenBank數據庫上傳比對，分別進行多序列比對分析和進化樹同源分析，最終結果采用自舉檢驗(Bootstraping)進行可信度統計分析。

1.5 MALDI-TOF MS蛋白質質譜鑒定 蛋白質質譜鑒定采用VITEK MS全自動快速微生物質譜檢測系統(法國生物梅里埃公司)，嚴格按照操作手冊進行操作獲取質量圖譜，并通過VITEK MS數據庫進行分析，從而獲得鑒定結果，定標菌株為大腸埃希菌ATCC8739。

1.6 統計學處理 采用ClustalX進行多序列比對，進化樹分析采用MEGA4.O軟件，統計分析采用自舉檢驗(Bootstraping)和UPGMA法。

2 結 果

2.1 gap基因序列分析 Gap基因擴增獲得目的條帶，純化后進行序列測定，獲得序列在GenBank中進行Blast比對。序列矩陣分析顯示各種細菌序列比對有較大差異(39%～98%)，未出現序列比對大于99%相似率，gap基因分析能完全區分CNS，表1。

表1 16種CNS gap基因矩陣比對分析

2.2 基因進化樹同源分析 Gap基因矩陣分析顯示有足夠序列差異，同時采用UPGMA算法構建CNS進化樹，同源分析顯示除路鄧葡萄球菌和溶血葡萄球菌可信度較低外(77%)，其他菌種統計可信度分析都在90%以上，進化樹統計算法都比較可信，相近菌種兩兩比較可信度分析甚至達到98%以上，圖1。

2.3 MALDI-TOF MS蛋白質質譜鑒定 16種CNS得出清晰的蛋白質質譜圖，如表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌MALDI-TOF MS蛋白質質譜圖(圖2)。與梅利埃已有數據庫進行比對發現，每種細菌鑒定率都大于99%以上，與gap基因鑒定的細菌種類完全符合(符合率100%)。

圖1 gap基因UPGMA法系統發育樹狀圖

圖2 表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌MALDI-TOF MS蛋白質質譜圖

3 討論

CNS致臨床感染病例日益增多，受到臨床重視，實驗室對CNS的鑒定主要通過表型的方法，但有些臨床菌株不能被準確鑒定到種，需要通過分子學的方法。目前細菌鑒定常采用16S rRNA基因方法[6-7]，但文獻研究顯示，由于葡萄球菌16S rRNA序列幾乎完全相同，不能用于葡萄球菌菌屬的分類鑒定[8]；而研究顯示gap基因能夠對葡萄球菌菌屬進行區分，特別是對相近的CNS進行準確鑒定[4，9]。本研究對gap基因序列分析顯示，16種CNS序列相似率為39%～98%，相似率最高人葡萄球菌和人葡萄球菌亞種(98%)，低于文獻常見報道的99%判斷標準[10-11],有足夠序列差異區分CNS；而gap基因序列同源分析顯示，16種CNS分析具有較高的可信度(大于77%)，因此通過gap基因序列分析，能夠對CNS種類進行準確鑒定。

近年來，隨著科技的發展，越來越多的診斷技術應用到細菌的鑒定，MALDI-TOF MS蛋白質質譜技術就是其中之一。MALDI-TOF MS蛋白質質譜技術在蛋白質水平上對細菌進行鑒定，與表型和分子鑒定相比，VITEK MS的MALDI-TOF MS蛋白質質譜技術具有如下特點：①自動化、快速和高通量，平均每分鐘完成1～2個菌株鑒定；②成本低廉，鑒定耗材成本低于傳統鑒定板條；③鑒定范圍涵蓋廣，可以對臨床常見病原菌進行準確鑒定。目前已有文獻對MALDI-TOF MS蛋白質質譜技術在微生物鑒定中應用進行研究，該方法已經逐步應用于臨床，要明顯優于傳統表型鑒定，在CNS鑒定過程中，具有快速、準確和價廉等特點[12-16]，我們在對16種CNS分子鑒定的基礎上，分別對CNS進行MALDI-TOF MS蛋白質質譜分析，發現該方法與gap基因鑒定方法具有100%的符合率，說明MALDI-TOF MS蛋白質質譜技術在CNS鑒定中，比傳統方法和分子方法具有優勢，可以用于CNS的快速和準確鑒定。