歸脾丸中黃曲霉毒素的測定及質量評價

楊 爽 馬文靜 高 婧 楊甲忠

（承德市食品藥品檢驗檢測中心 河北 承德 067000）

歸脾丸[1]始載于宋代嚴用的《濟生方》，由黨參、炒白術、炙黃芪、炙甘草、茯苓、制遠志、炒酸棗仁、龍眼肉、當歸、木香和大棗（去核）11味藥組成。具有益氣健脾，養血安神的功效，用于心脾兩虛，氣短心悸，失眠多夢，頭昏頭暈，肢倦乏力，食欲不振，崩漏便血。現行質量標準為《中國藥典》2015年版，設置的項目有性狀、鑒別、檢查、含量測定，并沒有對黃曲霉毒素的限量檢測方法。由于處方中含有炒白術、炒酸棗仁等多味藥材易產生真菌毒素，故本文旨在研究歸脾丸黃曲霉毒素測定方法，并應用于歸脾丸的檢測，進行質量評價。

1.儀器與試劑

1.1 Waters e2695高效液相色譜儀（沃特世有限公司）；MSS40S 分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；AG135分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）

1.2 黃曲霉毒素 乙腈為色譜純（fish 有限公司）；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

1.3 樣品

市場上購買35批樣品Y1-Y35，抽樣涉及6個省及直轄市生產企業11家，批準文號14個。

2.方法與結果

2.1 色譜條

以十八烷基鍵合硅膠（5μm，4.6×250mm）為填充劑；柱溫：40℃；以甲醇（A）-乙腈（B）-水（C）為流動相，流速1.1mL/min；采用光化學衍生法；光化學衍生器（254nm）；以熒光檢測器檢測，激發波長λex=360nm，發射波長λem=450nm。HPLC 梯度洗脫程序T：0 ～17 ～20 ～22 ～23min，A：10 ～10 ～10 ～10 ～10，B：25 ～45 ～65 ～65 ～25，C:65 ～45 ～25 ～25 ～65。進樣量 ：對照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，供試品溶液25μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密量取黃曲霉毒素對照品（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，標示濃度1.0μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL）0.5mL，置10mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲備液。精密量取儲備液1mL,置25mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品，精密稱取水蜜丸9g，蜜丸15g，剪碎，置于均質瓶中，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，超聲處理15分鐘使之分散均勻，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11000轉/分鐘），離心5分鐘（離心速度2500轉/分鐘），精密量取上清液15ml，置50ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用玻璃纖維濾紙濾過，精密量取續濾液20ml，通過免疫親和柱，流速每分鐘3ml，用水20ml洗脫，洗脫液棄去，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液置2ml 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 測定法

按照2.1項下色譜條件測定，以混合對照品的峰面積為縱坐標，不同進樣量為橫坐標，繪制標準曲線。另測定供試品峰面積，從標準曲線中讀出供試品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計算，即得。

2.4 回收率

精密稱取取Y1，3份各9g，剪碎，置于均質瓶中，加入氯化鈉3g，精密吸取混合對照品儲備液0.5mL 加入均質瓶中，按照2.2.2供試品溶液的制備，按照2色譜條件測定，計算回收率，分別為87.5%，90.1%，90.5%，符合要求。

2.5 結果

35批次樣品中有8批次檢出黃曲霉毒素，并經質譜驗證。對照圖譜見圖1，樣品圖譜(檢出）見圖2、(未檢出）見圖3。檢出數據見表1。

限度：按人體口服安全有效量制定，每1000g 含黃曲霉毒素B1不得過5μg，含黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2 和黃曲霉毒素B1的總量不得過10μg。

圖1 黃曲霉毒素混合對照品HPLC圖譜

圖2 Y15（批號160901）HPLC圖譜

圖3 Y10（批號17031005）HPLC圖譜

表1 8批次樣品檢出黃曲霉毒素數據表

結果：經檢驗，35次樣品全部符合規定。

3.討論

黃曲霉毒素(AFT)是一類化學結構類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素是主要由黃曲霉 (aspergillus flavus)寄生曲霉 (a.parasiticus)產生的次生代謝產物，在濕熱地區出現黃曲霉毒素的機率最高。它們存在于土壤、動植物、各種堅果中，特別是容易污染花生、桃仁，酸棗仁等油性大的植物中，是霉菌毒素中毒性最大、對人類健康危害極為突出的一類霉菌毒素。1993年黃曲霉毒素被世界衛生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為1類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質。黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至死亡.以黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強。B1是最危險的致癌物，經常在玉米，花生，棉花種子，一些干果中常能檢測到。它們在紫外線照射下能產生熒光，根據熒光顏色不同，將其分為B 族和G 族兩大類及其衍生物。

本文采用中國藥典中藥材黃曲霉毒素的檢查方法對成藥歸脾丸中黃曲霉毒素進行檢查，回收率為87.3%，說明此方法穩定、準確，可以直接應用于歸脾丸。

本文應用此方法對35批歸脾丸黃曲霉毒素進行檢查，結果有8批歸脾丸檢查出黃曲霉毒素，雖然都在人體中毒的限度內，但是有個別企業含量也偏高，而且同一廠家不同批號都含有黃曲霉毒素，要提高對個別企業的監管力度。相關標準有必要增加對黃曲霉毒素的檢查，控制歸脾丸的質量，提高人民的用藥安全。