人外周血染色體核型制備改良方法探討

龍艷喜，王衛(wèi)良，唐 莉，楊 琴，莫 暉，武 釗，王華偉

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 生殖遺傳科，云南 昆明 650032；2.31695部隊醫(yī)院，山東 青島 266200；3.昆明市五華區(qū)人民醫(yī)院，云南 昆明 650032）

人外周血染色體培養(yǎng)制備方法廣泛運用到臨床，是臨床遺傳學(xué)診斷中最基本和最有效的經(jīng)典檢測方法[1]，為臨床疾病的預(yù)防及診斷提供了有效依據(jù)。雖然當(dāng)前人外周血染色體細(xì)胞培養(yǎng)及制備已在臨床大量應(yīng)用，但是每個實驗室的實驗環(huán)境及相應(yīng)設(shè)備條件并不相同，實驗操作人員操作手法和個人理解也存在很大的差異，導(dǎo)致目前仍然沒有一個可以執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)操作方法。在人外周血染色體核型制備過程中，因操作步驟較多，每一個步驟操作過程中均會受到多種影響因素的干擾。操作人員任何的操作改變都會影響染色體核型最終的制備效果，甚至導(dǎo)致實驗失敗[2]。因此，得到結(jié)果穩(wěn)定、質(zhì)量較好的染色體核型結(jié)果一直是該實驗技術(shù)的關(guān)鍵[3]，也是目前染色體核型制備過程中大家不斷探索的方向[4]。筆者通過反復(fù)實踐后發(fā)現(xiàn)改良的方法能有效縮短核型制備的操作時間，操作簡便，能得到更為清晰的染色體核型，并且實驗結(jié)果也比較穩(wěn)定，能顯著提高檢測分析診斷效率，現(xiàn)將方法報告如下。

資料與方法

一、一般資料 2017年4月-12月我室進(jìn)行人外周血染色體培養(yǎng)制備1 630例標(biāo)本，在方法改良前后的數(shù)據(jù)中隨機挑選改良前制備標(biāo)本200份和改良后制備標(biāo)本200份，統(tǒng)計分析改良前后染色體分裂相數(shù)量及核型的效果。

二、儀器與試劑 Axio Imager Z2＆Metasystems全自動掃描染色體圖像分析系統(tǒng)，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，秋水仙素10mg/mL和80mg/mL，胰酶（Gibco），0.075mol/L的氯化鉀溶液，固定液（甲醇與冰乙酸按3∶1新鮮配制），PH7.4磷酸鹽緩沖液，吉姆薩染液。

三、方法 1.細(xì)胞培養(yǎng) 用一次性2.5mL注射器取0.5mL（改良法為0.8mL）肝素抗凝血到5mL淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻放5%CO2，37℃±0.5℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h（改良法為96h）。

2.秋水仙素作用 收獲細(xì)胞前90～120min（改良法為20min） 在培養(yǎng)基中加入濃度為10μg/mL（改良法為80μg/mL） 的秋水仙素0.1mL使最終濃度為0.2μg/mL（改良法為1.6μg/mL），37℃±0.5℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)處理90min（改良法為20min）。

3.低滲處理 秋水仙素處理完畢后，小心地從溫箱取出培養(yǎng)瓶，用吸管吸取培養(yǎng)物入10mL錐形離心管內(nèi)，離心（2000轉(zhuǎn)，8min） （改良法為1700轉(zhuǎn)，7min）。然后加入37℃溫育的0.075mol/L的氯化鉀溶液低滲液8mL，用吸管吹打成細(xì)胞懸液，置37℃水浴處理30min（改良法為20min）。

4.預(yù)固定 在每個離心管中加入2mL的固定液，混勻，2000轉(zhuǎn)，離心8min（改良法為1700轉(zhuǎn)，離心7min），棄上清液。

5.固定 在離心管中加入固定液8mL，立即用吸管輕輕吹打成單個細(xì)胞懸液，2000轉(zhuǎn)，離心8min（改良法為1700轉(zhuǎn)，離心7min），棄上清液。連續(xù)固定2次即可。

6.制片 在錐形離心管中滴入新鮮固定液0.5mL，用吸管將淋巴細(xì)胞團(tuán)輕輕吹打成細(xì)胞懸液，從冰箱的冷凍室內(nèi)取出冰片，每片滴加懸液4～5滴，每份標(biāo)本滴2張片子。

7.老化 80℃烤片2h，進(jìn)行顯帶，一般需盡快進(jìn)行顯帶。

8.顯帶 一般用0.25%胰酶溶液顯帶后吉姆薩染液染色。顯帶前先挑出4片試片，胰酶消化時間從35秒鐘開始，pH7.4磷酸鹽緩沖液中漂洗3秒鐘，染色液中染色8min或更長時間，然后用用自來水輕輕沖洗兩面，室溫干燥后上機鏡檢。找出條帶清晰的條件批量消化染色處理。

四、統(tǒng)計學(xué)處理 隨機抽取實驗方法改良前和改良后的標(biāo)本各200份，統(tǒng)計染色體分裂相總數(shù)和可用于分析的優(yōu)質(zhì)核型數(shù)目，基于SPSS18.0進(jìn)行非參數(shù)秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、改良前后人外周血染色體核型結(jié)果 改良的人外周血染色體細(xì)胞培養(yǎng)和染色體制備方法獲得的染色體分裂相數(shù)量明顯增加，核型分散度會更好，長短適中的中期細(xì)胞會更多，顯帶后帶紋更清晰，便于結(jié)果的分析診斷，見圖1。

二、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果 為了進(jìn)一步分析上述不同方法對實驗結(jié)果的影響是否存在顯著差異，我們對實驗條件更改前后隨機挑選各200份標(biāo)本，分別進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表1。

1.分裂相數(shù)量統(tǒng)計 統(tǒng)計改良前培養(yǎng)72h和改良后培養(yǎng)96h各200份樣本，每份樣本掃描1張片，統(tǒng)計所掃描的全部分裂相。改良前200份樣本總的獲得25 371個分裂相；明顯少于改良后200份樣本獲得的61 810個分裂相。非參數(shù)秩和檢驗Z=-13.421（P=0.000，P＜0.05），提示改良后，分裂相顯著增多，2組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異意義。

2.可用的優(yōu)質(zhì)核型統(tǒng)計 分析改良前后染色體核型效果，在固定每張片分析固定數(shù)目核型的前提下，統(tǒng)計其中可分析的優(yōu)質(zhì)核型數(shù)。改良前200份標(biāo)本中獲得的10 000個分裂相中，可用的優(yōu)質(zhì)核型數(shù)為1 038個，明顯少于改良后2 210個，非參數(shù)秩和檢驗Z=-12.493（P=0.000，P＜0.05）見表2，提示改良后標(biāo)本的可用的優(yōu)質(zhì)核型顯著增多，2組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異意義。結(jié)果表明技術(shù)改良可以有效的改善外周血染色體核型制備過程中存在的細(xì)胞分裂相少和染色體核型條帶質(zhì)量差的現(xiàn)狀。

討 論

一、標(biāo)本接種 我們常規(guī)方法是接種0.5mL肝素抗凝血，之后改良法為接種0.8mL肝素抗凝血，細(xì)胞核型明顯增多，接種量的多少還應(yīng)根據(jù)實驗室情況決定。接種血液量的多少也會對培養(yǎng)結(jié)果有影響，接種的太少，細(xì)胞稀薄，減慢了細(xì)胞生長速度；接種的太多，培養(yǎng)過程中細(xì)胞的營養(yǎng)成分不夠，影響生長，難以得到合適的細(xì)胞。嬰幼兒患者因外周血淋巴細(xì)胞中血紅素含量高，會影響細(xì)胞的生長，我們適當(dāng)減少接種量會改善細(xì)胞生長情況。因此，我們要本著年齡越小，接種量越少的原則進(jìn)行種植細(xì)胞，4歲以下兒童接種量約為成人外周血接種量的4/5，新生兒約為成人外周血接種量的2/5[5]。接種后的肝素抗凝血標(biāo)本放4℃冰箱保存?zhèn)溆?，?dāng)有標(biāo)本需要復(fù)查時可混勻后再次接種，我們最長接種保存了11d的樣本，仍然能得到很好的細(xì)胞核型[5]。同時患者可以隨時采集標(biāo)本，放冰箱儲存后集中處理，這樣減少了患者往返醫(yī)院的不便，極大的方便了患者標(biāo)本采集，為患者節(jié)約了寶貴時間。影響人外周血染色體培養(yǎng)的因素非常多，比如實驗室環(huán)境、操作人員的操作手法和經(jīng)驗、標(biāo)本本身質(zhì)量等，我們通過總結(jié)發(fā)現(xiàn)溶血標(biāo)本和近期使用過抗生素治療的標(biāo)本，接種培養(yǎng)后很少能得到細(xì)胞核型，這是導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的最主要原因，在采集樣本時就需要特別注意詢問患者近期服藥情況，按標(biāo)準(zhǔn)流程采血，采血過程要流暢，避免接種有質(zhì)量問題的標(biāo)本，這能有效的減少培養(yǎng)失敗的情況。

二、培養(yǎng)時間 以前常規(guī)培養(yǎng)時間為72h，之后我們試過培養(yǎng)48h，發(fā)現(xiàn)染色體分裂相較少。培養(yǎng)96h較72h細(xì)胞分裂相增多2倍多，如果有更多的細(xì)胞分裂相在篩選時就可以留下更多優(yōu)質(zhì)的染色體核型，能得到更為清晰的染色體核型結(jié)果，這樣顯著提高了檢測分析診斷效率。我們根據(jù)標(biāo)本量集中接種，集中處理，減少了很多重復(fù)操作時間，極大的節(jié)約了標(biāo)本制備的工作時間。

三、秋水仙素作用 秋水仙素的作用原理是通過干擾細(xì)胞中微管組裝，抑制紡錘絲的進(jìn)一步形成，讓細(xì)胞停留在有絲分裂的中期[6]。加入秋水仙素的數(shù)量濃度、培養(yǎng)作用時間與細(xì)胞有絲分裂中期分裂相的多少及染色體的形態(tài)密切相關(guān)[7]。秋水仙素的作用濃度越高或者培養(yǎng)作用時間越長，能得到的中期分裂細(xì)胞就會越多，相反，如果秋水仙素的作用濃度越低或者培養(yǎng)作用時間越短，得到的中期分裂細(xì)胞就會越少。根據(jù)這個原理我們運用到改良方法中，加大了秋水仙素的濃度，減少了培養(yǎng)作用時間，僅這個步驟就節(jié)約1h多的作用時間，并且染色體的大小及分散情況更好，最終顯帶效果比常規(guī)方法條帶更清晰，更容易發(fā)現(xiàn)異常結(jié)果，極大地提高工作人員檢測診斷能力。

圖1 改良前后外周血染色體核型原始結(jié)果比較

表1 改良前后主要操作步驟的改變情況

表2 改良前后分裂相數(shù)量和效果比較

四、低滲處理 低滲處理是人染色體標(biāo)本制備中很重要的一步操作，低滲的作用是使細(xì)胞膜破裂，把染色體分散開，滴片時更好的平鋪于玻片上，清除干擾染色體背景下雜質(zhì)，便于染色體分散著色等[8]。如果低滲時間太短，分散良好的染色體會減少，干擾雜質(zhì)偏多，顯帶效果變差，若低滲時間較長，又會使染色體破裂丟失很多，最后也無法分析結(jié)果[9]。筆者在實驗工作中通過摸索低滲10min，15min，20min，25min及30min條件發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蜐B時間為20min和25min時均可得到質(zhì)量較好的染色體核型結(jié)果。因此，筆者將低滲處理時間改良為20min，方法與學(xué)者徐本錦[10]的一致。低滲過程中，低滲操作的時間和操作手法直接影響著最終染色體分散及顯帶的效果[11-13]。低滲液操作前30min需放37℃的水浴箱中恒溫備用，要充分讓低滲液與細(xì)胞液吹打混勻。

五、離心處理 離心處理的方法也影響著最終染色體核型的結(jié)果，操作時需要合適的離心力大小和離心時間[2]。離心力太小，干擾雜質(zhì)不易清除，固定效果變差，顯帶效果差，染色體模糊不便分析，若離心力太大，低滲好的細(xì)胞容易破碎，大量染色體丟失，顯帶后檢測會出現(xiàn)染色體太少或沒有的情況，導(dǎo)致結(jié)果分析困難。筆者改良后在1700轉(zhuǎn)條件下離心7min可得到的染色體數(shù)量比較合適。

綜上所述，通過工作實踐，改良方法比常規(guī)方法所得到的染色體核型顯帶結(jié)果質(zhì)量更好，操作更簡便，結(jié)果更穩(wěn)定。實驗操作時間也可根據(jù)工作需要靈活調(diào)整，標(biāo)本可集中接種統(tǒng)一收獲細(xì)胞，有效地節(jié)約了大量的工作時間，減少了重復(fù)的工作流程和試劑的反復(fù)浪費，且提高了檢測質(zhì)量和工作效率，同時增加了患者的服務(wù)體驗，因此筆者認(rèn)為改良方法是一種操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定、顯著提高分析診斷效率、有效的節(jié)約成本、有利于科室及患者的方法。