芘污染土壤的根瘤菌-植物修復效應研究

黃河 ，張超蘭*，周永信，謝湉，廖長君*

1. 廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004；2. 廣西博世科環(huán)保科技股份有限公司，廣西 南寧 530007；3. 廣西大學資源環(huán)境與材料學院，廣西 南寧 530004

多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbon，PAHs）是由兩個或者兩個以上的苯環(huán)構(gòu)成的疏水性有機污染物，環(huán)境中普遍存在的具有“三致”毒性的持久性有機污染物（POPs），容易吸附于沉積物上，覆于水中懸浮顆粒物中，且優(yōu)先向非水相體系轉(zhuǎn)移，土壤是其最主要的環(huán)境介質(zhì)之一（Zhang et al.，2015；Adeleye et al.，2016）。PAHs能在土壤中不斷累積，破壞土壤環(huán)境質(zhì)量，進而影響土壤的正常功能。環(huán)境中的PAHs主要來源包括：化石燃料燃燒、石化產(chǎn)品生產(chǎn)、化肥農(nóng)藥施用等。PAHs能夠通過食物鏈進入人體，干擾人體內(nèi)分泌活動的正常進行，危害人體健康（Hawliczek et al.，2012；Mahanty et al.，2010）。目前，PAHs已被歐盟和美國環(huán)保局列為優(yōu)先控制污染物，并把其中的 16種作為環(huán)境污染的監(jiān)測參數(shù)（Wise et al.，2015）。

生物修復技術是目前修復治理PAHs污染土壤的重要手段之一，其包括了植物修復、微生物修復和植物-微生物聯(lián)合修復。植物修復是指植物通過吸收累積、改善土壤理化性質(zhì)以及提高土壤微生物的活性等作用來降低土壤污染物的濃度（Kuppusamy et al.，2017）。已有研究表明植物修復能降低土壤中PAHs的濃度（Petrova et al.，2017；Tejeda-Agredano et al.，2013；Somtrakoon et al.，2014），但是單純的植物修復對PAHs污染土壤的修復效率不高。微生物的分解與代謝，是土壤中PAHs降解的主要途徑之一，但是土壤理化性質(zhì)復雜，在不同的土壤中，降解菌的存活差異巨大，進而導致微生物修復效率的不穩(wěn)定。植物-微生物聯(lián)合修復結(jié)合了植物修復和微生物修復的優(yōu)點，能夠強化土壤污染物的降解作用。一方面，植物發(fā)達的根系為微生物提供適宜的生長條件，促進其活性；另一方面，微生物能夠降解有機污染物，減輕污染物對植物的毒害，提高植物的耐受性，同時為植物帶來生長必需的各類營養(yǎng)元素，并提高植物對污染物的吸收積累和轉(zhuǎn)化效率。研究表明紫花苜蓿接種木霉后促進了植物的生長，并且提高了土壤中的PAHs的降解率（姚倫芳等，2014；Tripathi et al.，2013）；紫花苜蓿與菌株（Fusarium sp. strain ZH-H2）聯(lián)用加快了土壤中PAHs的降解（Shi et al.，2018）。目前用于修復PAHs污染土壤的植物主要有玉米、黑麥草和紫花苜蓿等，PAHs的降解菌主要包括內(nèi)生細菌以及根瘤菌等（Zafra et al.，2015；Ren et al.，2017）。

本文以芘（Pyrene）作為目標污染物，一種土壤中常見的 PAHs，是一種四環(huán)芳烴。并以綠豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum），紫花苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）為供試菌株，選用綠豆（Vigna radiata L.）、花生（Arachis hypogaea L.）和紫花苜蓿（Medicago sativa L.）這3種能夠和根瘤菌共生且可用以肥田的植物作為研究對象。并以黑麥草（Lolium perenne L.）作為對比，黑麥草不能和供試根瘤菌共生，作為參考作用，用以考察根瘤菌在不形成根瘤的時候會否對修復效果產(chǎn)生影響。采用盆栽實驗研究接種根瘤菌對4種植物修復芘污染土壤的效果，為今后利用植物微生物修復芘污染土壤提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤為水稻土，采自廣東省增城市，采樣深度為0－20 cm，土壤經(jīng)自然風干，剔除雜物后過2 mm的篩網(wǎng)，置于干燥處密封保存，備用（Sun et al.，2010）。土壤理化性質(zhì)的測定參照《土壤農(nóng)化分析》（鮑士旦，2008），其中，土壤 pH值 4.50，有機質(zhì)16.3 g·kg-1，總氮 86 mg·kg-1，總磷 52 mg·kg-1，總鉀 448 mg·kg-1，總有效磷 35 mg·kg-1，速效鉀 26 mg·kg-1，未在土壤中檢測出芘。

芘購自sigma公司，純度＞98%。綠豆品種為綠珍珠，種子購自駐馬店泌陽鑫豐科技有限公司。紫花苜蓿，黑麥草，花生種子購自武漢華中農(nóng)業(yè)大學。綠豆根瘤菌，紫花苜蓿根瘤菌購自寧夏諾德曼生物技術有限公司。

1.2 實驗設計

1.2.1 人工污染土壤

稱取5.4 kg供試土壤，逐漸加入溶解了5.4 g芘的二氯甲烷溶液，多次攪拌混勻，將處理過的土壤置于通風櫥中24 h，待二氯甲烷揮發(fā)后過2 mm篩網(wǎng)3次，再次混勻。然后，將其分少量多次加入48.6 kg供試土壤中，攪拌，過2 mm篩網(wǎng)3次，使土壤盡量混勻，最終使土壤中芘的濃度達到 100 mg·kg-1。整個過程在密閉箱子中操作，盡量減少揚塵，避免污染物轉(zhuǎn)移，造成污染。

1.2.2 盆栽實驗

每種植物設置4個處理：CN－污染土壤、CV－污染土壤+根瘤菌、NN－清潔土壤、NV－清潔土壤+根瘤菌。同時設置無植物對照組，用于考察在無植物條件下，污染土壤中芘的自然降解率。每個處理設置3個重復。具體操作為：稱取2 kg對應土壤于具底蓋塑料花盆（d=18 cm，h=16 cm）中，加蒸餾水至田間持水量的60%，穩(wěn)定10 d后測定土壤中芘的濃度作為本底值（經(jīng)過陳化后土壤中芘的起始濃度為90.32 mg·kg-1）。選取飽滿大小一致的4種植物的種子，經(jīng)離子水清洗后用3%的H2O2浸泡20 min，然后用去離子水清洗3次。待其表面風干后，CV和NN處理組直接播種，CV和NV處理組按菌劑說明進行接種，黑麥草同時接種綠豆根瘤菌和苜蓿根瘤菌，由于根瘤菌具有專一性，黑麥草不能和供試根瘤菌共生，本實驗中作為參考作用，用以考察根瘤菌在不形成根瘤的時候是否對修復效果產(chǎn)生影響。每盤播種 20顆種子，播種后一周間苗，選留生長狀態(tài)相似的植株，其中綠豆和花生各留4株，黑麥草和紫花苜蓿各留10株。將盆栽置于玻璃網(wǎng)室中培養(yǎng) 60 d，培養(yǎng)期間日平均溫度為35 ℃，每天傍晚利用重量法從盆底澆水，使土壤保持在田間持水量的60%，并每隔兩天隨機改變花盆位置一次。培養(yǎng)結(jié)束后，于室內(nèi)通風陰暗處進行采樣，采樣時將土整盆倒出，小心分離根和土壤，統(tǒng)計每盆植株根系上的根瘤個數(shù)。植物地上部分用自來水清洗后再用去離子水充分淋洗，地下部分先用超聲波清洗儀清洗再用去離子水淋洗，用濾紙蘸干表面水分后放入密封袋。將暫時無法處理的樣品放入-20 ℃的冰箱中儲存，備用。土壤樣品采集后，充分混勻，過 20目篩，測定土壤中芘的含量以及脫氫酶活性。

1.3 分析檢測方法

采用電位法測定土壤的pH值（水土質(zhì)量比為1∶2.5）。采用TTC分光光度法測定土壤脫氫酶活性（Masto et al.，2011）。采用HPLC/UV分析土壤芘含量，具體為取2.00 g土樣于30 mL玻璃離心管中，加入10 mL二氯甲烷，超聲（添加冰塊使水溫不超過 40 ℃）萃取 1 h后于4000 r·min-1下離心20 min；取3 mL上清液過2 g硅膠柱；再用1∶1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脫。雞心瓶收集洗脫液后，在40 ℃下濃縮至接近干；用甲醇定容，過0.22 μm有機相濾膜后，用HPLC/UV分析。液相色譜的條件：紫外檢測器，d=4.6 mm、l=150 mm C18反相色譜柱，柱溫 30 ℃，流動相為甲醇-水 83∶17，流速 1.0 mL·min-1（Gao et al.，2004；宋玉芳等，1995）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，利用Origin 8.0進行繪圖。土壤pH、脫氫酶活性、芘降解率和植物生物量等指標采用單因子方程分析（ANOVA）進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌適應性

如圖1所示，無論在污染土壤（CN）還是清潔土壤（NN）中，紫花苜蓿均未成功接種上根瘤菌，而黑麥草根際則沒有根瘤生成。在不接種根瘤菌的污染土壤和清潔土壤中，綠豆和花生根瘤數(shù)沒有顯著差異。接種根瘤菌后，綠豆和花生根系上的根瘤數(shù)要顯著多于比無接種的對照組，同時綠豆的根瘤數(shù)要顯著多于花生，在污染土壤中綠豆根瘤數(shù)是花生的2.16倍，在清潔土壤中則為1.54倍。對于綠豆來說，芘對根瘤數(shù)沒有明顯的抑制作用；而芘對花生根系根瘤的數(shù)目有一定的抑制作用，對比清潔土壤，根瘤數(shù)下降了28.17%。

圖1 根瘤菌在不同植物根系的生長情況Fig. 1 Growth of Rhizobium in roots of different plants

2.2 不同處理對土壤pH的影響

土壤pH值如圖2所示，無論在污染土壤（CN）還是清潔土壤（NN）中，綠豆、花生和黑麥草處理的土壤 pH均有所增加，其中綠豆處理對于 pH的提升效果最好，然后依次為花生和黑麥草。

圖2 土壤pH值變化Fig. 2 The changes of soil pH in different treatments

在污染土壤中，無植物處理組的土壤 pH為4.44，綠豆、花生、黑麥草和紫花苜蓿處理土壤pH較無植物處理分別提高了 15.92%、6.46%、4.88%和1.43%。而在清潔土壤中，種植植物后，綠豆、花生和黑麥草處理土壤 pH較原土分別增加了15.26%、5.63%和 3.93%，而種植紫花苜蓿后土壤pH降低了0.67%。接種根瘤菌后，在污染土壤中，種植綠豆、花生和黑麥草的土壤的pH值均有略微提高，分別提高了0.52%、0.42%和0.93%；紫花苜蓿接種根瘤后使土壤pH值降低了1.33%。而在清潔土壤中，植物接種根瘤菌后，土壤pH與不接種根瘤菌組無明顯差異。

2.3 不同處理對植物生物量的影響

圖3 不同植物地上部生物量Fig. 3 Shoot biomass of different plant in different treatments

圖4 不同植物根系生物量Fig. 4 Root biomass of different plant in different treatments

培養(yǎng)60 d后，綠豆、花生、紫花苜蓿和黑麥草在不同處理中的莖葉生物量干重及根部生物量干重如圖3和圖4所示。由圖3可以看出4種植物的莖葉生物量順序分別為：綠豆＞花生＞黑麥草＞紫花苜蓿。綠豆和花生的莖葉生物量要顯著大于紫花苜蓿和黑麥草，綠豆的莖葉生物量相當于紫花苜蓿的6倍。各植物根系生物量的順序與莖葉一致。在芘污染土壤中，4種植物的生物量均有一定幅度的下降，對于地上部來說，綠豆、花生、紫花苜蓿和黑麥草的生物量分別下降了 6.07%、5.47%、10.22%和0.48%。對于地下部來說，綠豆、花生、的生物量則分別降低了10.79%、7.96%和8.36%，而黑麥草則上升了1.82%。這表明芘對4種有一定的毒害作用，其中黑麥草受到的影響最小。對于綠豆和花生來說，接種根瘤菌能有效的緩解這種毒害作用，接種根瘤菌后綠豆地上部和地下部的生物量分別提高了 3.18%和 10.12%，花生則提高了 4.96%和6.06%，接種根瘤菌緩解了芘對綠豆和花生的毒害作用。

2.4 不同處理對土壤脫氫酶活性的影響

由圖5可以看出，經(jīng)過60 d的培養(yǎng)，4種植物均提高了土壤脫氫酶的活性。種植綠豆的污染土壤的脫氫酶活性最高，其次是花生，但兩者之間沒有顯著差異。接種根瘤菌提高這兩種植物土壤中的脫氫酶活性，但這種差異并不明顯，其中綠豆處理組中提高了9.70%，花生處理組中提高了2.05%。而種植紫花苜蓿和黑麥草的污染土中脫氫酶活性要低于綠豆和花生。

圖5 各處理土壤脫氫酶活性的變化Fig. 5 Soil Dehydrogenase activity in different treatments

2.5 不同處理對不同植物去除芘的影響

由圖6可知，在無植物的情況下，土壤中芘的去除率為56.82%。種植4種植物均提高了土壤中芘的去除率，其中對芘的去除效果最好的是綠豆，對比無植物處理，去除率由56.82%上升到90.52%，增加了33.70%。其后依次為：花生、黑麥草和紫花苜蓿，相應處理中土壤芘的去除率分別為78.45%、67.37%和 64.54%，對比無植物對照組分別提高了21.63%、10.55%和7.72%。接種根瘤菌后綠豆和花生對芘的去除率有一定的提高，接種根瘤菌使綠豆和花生對芘的去除率分別提高了4.10%和2.02%。而紫花苜蓿和黑麥草接種根瘤菌后，土壤芘的去除率幾乎沒有改變。

圖6 植物對土壤芘的去除效果Fig. 6 Pyrene removal in soils under different treatments

3 討論

植物修復是土壤有機污染修復的重要組成部分，豆科植物和黑麥草對土壤中PAHs均有不同程度降解效果（沈源源等，2011）。本研究的結(jié)果表明，綠豆、花生、紫花苜蓿和黑麥草在芘污染土壤中的長勢良好，種植植物的處理組中土壤芘的含量均要顯著低于未種植植物的處理組，這說明4種植物對芘有著較好的耐受性，并且提高了土壤中芘的去除率。植物能夠通過吸附和累積的形式去除土壤中的有機污染物，而且期根系分泌物能夠與有機污染物發(fā)生絡合和降解作用，而根系釋放到土壤中酶也促進了污染物的降解（張娟等，2016）。潘聲旺等（2009）的研究表明，植物累積對于土壤中PAHs的去除率貢獻值比較低，而植物主要是增強了土著微生物對土壤PAHs的降解作用（戴青松等，2014）。植物修復中植物通過改變土壤微生物的生存環(huán)境來影響微生物的活動，包括改變含水量，pH以及釋放有機物，為根際微生物輸送更多的營養(yǎng)物質(zhì)等（董洪梅等，2011）。土壤pH是影響PAHs降解的一個重要因素，研究表明當土壤pH范圍在5.0－9.0時，有利于PAHs的降解，中性環(huán)境中生物降解作用更強（Chang et al.，2008）。豆科綠肥植物可以作來調(diào)節(jié)土壤酸度（Yan et al.，2000），在污染土壤中，種植4種供試植物均提高了土壤的pH值，其中綠豆處理組的pH值為5.15，處于有利于PAHs降解的區(qū)間，因此該處理中PAHs的降解速率也最快。此外，土壤pH還會影響土壤酶參與的生化反應速度，有的酶促反應對pH變化很敏感，只能在較窄的pH范圍內(nèi)才能進行，合適的pH也為土壤酶提供根適宜的環(huán)境。脫氫酶是一種氧化還原酶，在環(huán)狀化合物的分解轉(zhuǎn)化過程中起著重要的作用（劉世亮等，2007），本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)土壤的脫氫酶活性對芘污染頗為敏感（張慧等，2010；宮璇等，2004），相關研究也表明土壤脫氫酶和土壤中芘的去除率成正相關的關系（張慧等，2010；范淑秀等，2007）。種植植物使土壤脫氫酶的活性明顯提高，從而促進了芘的降解。此外，種植植物后，土壤中芘的去除率的提高幅度與植物生物量的變化趨勢一致，表明植物的生物量是影響土壤芘降解速率的重要因素。總的來說，綠豆有著較大的生物量，對土壤酸化有著較好緩沖效果，使pH值維持在穩(wěn)定的范圍，有利于土壤保持較高的脫氫酶活性，從而提高芘的降解率。在植物修復的過程中，接種特定的微生物有助于促進土壤中 PAHs的降解，提高植物修復的效率。沈源源（2010）研究發(fā)現(xiàn)不同品種紫花苜蓿與根瘤菌聯(lián)合修復后，紫花苜蓿-根瘤菌能顯著促進土壤中各組分PAHs的去除，比單種植物提高了大約 20%的去除率。在本研究中，根瘤菌劑并沒能使紫花苜蓿成功的接種上根瘤菌，這可能是該根瘤菌劑所包含的微生物并不能實驗所處的溫度環(huán)境。實驗進行的時間剛好是夏天，日平均溫度在 30 ℃以上，日最高氣溫 45 ℃，而花盆的土量相對較少，對環(huán)境溫度的緩沖能力較小，植物的根溫很容易達到環(huán)境溫度，這可能導致根瘤菌在紫花苜蓿發(fā)芽前還沒入侵紫花苜蓿根系就已經(jīng)滅活，或者一直處于休眠的狀態(tài)。接種根瘤菌后，綠豆和花生處理組中土壤芘的去除率有一定的提高，一方面，接種根瘤菌使綠豆和花生的根部的生物量有所增加；另一方面，接種根瘤菌使種植綠豆和花生的芘污染土壤的脫氫酶活性有所提高；這都將有利于芘的降解。但這種差異并不明顯，這可能是由于供試土壤氮元素含量較多，無需通過根瘤菌獲取額外氮源（藺蕊等，2004），不接種根瘤菌的綠豆根系生物量依舊較大，能夠為根際微生物提供同等類似的條件，且與根瘤菌共生的根系面積畢竟只是占了土壤總量的少數(shù)，而本實驗中的土壤樣品采集的是總體的土壤樣品并非根際土壤，這可能也是添加根瘤菌對土壤修復效果的影響不明顯的原因。

4 結(jié)論

較其他3種植物，種植綠豆對土壤酸化具有較好的緩存效果，能使土壤的pH保持在一個比較穩(wěn)定的范圍，對PAHs污染土壤具有較好的修復效果，其對芘的去除率相對于無植物對照組提高了33.70%，此外還提高了土壤的脫氫酶活性。接種根瘤菌提高了綠豆和花生對土壤中 PAHs的去除能力，其中根瘤菌接種綠豆對土壤芘的去除率達到94.63%。綠豆能夠適應本實驗所處的高溫環(huán)境，具有較大的生物量，根系發(fā)達，這能為土著微生物提供更多的碳源，使土壤微生物生長更加旺盛；其根系能與根瘤菌結(jié)合的更好，說明綠豆根瘤菌具有很好的適應性，這使綠豆具有培肥土壤的潛力。