基于Biolog指紋解析黑土灘退化草地土壤微生物群落特征

劉燕，李世雄, ，尹亞麗，趙文，王玉琴

1. 青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016；青海省畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016 2. 三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室/青海大學，青海 西寧 810016

近年來，由于全球氣候的變化以及過度放牧、害鼠破壞、風蝕、水蝕和凍融剝離等人為和自然因素的綜合影響，高寒草甸草場植被和土壤受到嚴重破壞，草皮層剝落，土壤裸露，草地日漸退化成植被稀疏的黑土灘退化草地（楊力軍等，2005）。黑土灘退化草地是以嵩草屬（Kobresia）植物為建群種的高寒草甸草場退化后經風蝕和水蝕形成的大面積的或島狀的次生裸地，其海拔分布范圍為3000－5000 m（尚占環等，2018；馬玉壽等，2006；馬玉壽等，1999）。其基本特征表現為：生草層的禿斑化，裸露土壤呈黑色，原生植被毒雜草化，莎草類基本消失。草地退化主要體現在植被逆向演替，其核心是土壤環境惡化（蔡曉布等，2007），植被-土壤-土壤微生物系統破壞，生態穩定性降低。在恢復黑土灘退化草地生態系統時，不僅要恢復植被，還要兼顧土壤環境，重建土壤微生物生態系統。

土壤微生物是草地生態系統的重要組成部分，是土壤中細菌、真菌、放線菌以及藻類的總稱，其在降解土壤有機質，調節植物生長及促進土壤結構的形成等方面有著不可替代的作用（譚紅妍等，2014）。土壤微生物對土壤生態變化十分敏感，能對環境變化做出快速響應并反向作用于其周圍的微環境（尹亞麗等，2018；孫瑞等，2015）。分析以往文獻，有關黑土灘退化草地的報道多集中于黑土灘退化草地恢復治理（李世雄等，2012；董全民等，2011）、土壤理化性質（Wu et al.，2010；周萬海等，2008）及土壤酶活性（尹亞麗等，2017；韓發等，2007）等方面，鮮有對黑土灘退化草地土壤微生物群落組成及功能特征的系統研究，關于黑土灘退化草地形成機理尚不明確，且對不同地區黑土灘退化草地土壤微生物群落空間異質性的相關研究報道較少。有關黑土灘退化草地土壤微生物的研究主要側重于微生物數量的研究，盧虎等（2014）采用平板表面涂抹法和稀釋法對天祝高寒草地土壤三大類微生物和氮素生理群特征進行了研究，認為黑土灘土壤微生物主要分布在0－20 cm，三大類微生物數量以細菌最多、真菌最少；氮素生理群數量以好氣性固氮菌最多、嫌氣性固氮菌最少。天祝高寒生態脆弱區不同擾動生境（一年生草地、多年生草地、圍欄內草地、圍欄外草地和黑土灘退化草地）下，黑土灘退化草地土壤真菌及放線菌數量最多（盧虎等，2013）。然而傳統的平板培養只能反映極少數微生物的信息，且所測結果誤差較大（朱菲瑩等，2017），因此，近年來土壤微生物多樣性的研究方法從傳統的培養法發展到了 Biolog微平板法、磷脂脂肪酸圖譜分析法及高通量測序等生理代謝和分子生物學研究方法。其中利用Biolog-ECO微平板法對微生物群落功能多樣性進行研究，可以根據不同的微生物群落對不同單一碳源的利用類型不同，反映出微生物代謝功能多樣性（黨雯等，2015；田雅楠等，2011）。雖然Biolog微平板法存在只能描述土壤中快速生長型或富營養微生物類群的活性，而不能反映土壤中生長緩慢的微生物信息等不足之處，但該方法可快速、簡便地獲得大量土壤微生物群落結構和功能多樣性方面的信息，仍被認為是一種較好的研究方法（呂昌勇等，2012）。

鑒此，本研究以青海省海北、果洛、玉樹3個地區黑土灘退化草地的土壤微生物為研究對象，采用 Biolog-ECO微平板法，對微生物的平均顏色變化率、微生物物種多樣性指數、微生物群落功能多樣性與植被特征的關系進行了研究，旨在為黑土灘退化草地植被恢復與土壤改良提供理論依據。

1 研究區域與研究方法

1.1 研究區概況

研究區位于青海省海北藏族自治州祁連縣野牛溝鄉（簡稱野牛溝YNG，年均氣溫1 ℃，年降水量415.5 mm）、青海省果洛藏族自治州瑪沁縣大武鎮（簡稱大武DW，年均氣溫-3.9 ℃，年降水量513.2－542.9 mm）及青海省玉樹藏族自治州玉樹縣巴塘鄉（簡稱巴塘 BT，年均氣溫 2.9 ℃，年降水量487 mm）（表1）。三地黑土灘退化草地主要植物為細葉亞菊（Ajania tenuifolia）、冷蒿（Artemisia frigida）、臭蒿（A. hedinii）等。

1.2 試驗方法

2017年8月，在野牛溝鄉、大武鎮和巴塘鄉選擇重度黑土灘退化草地作為樣地。選擇依據為：草地為灘地，禿斑地蓋度高，可食牧草比例低，退化指示植被比例高等（馬玉壽等，2008）。每個樣地內設置4個400 m2的試驗小區作為重復，每個小區分別調查4個50 cm×50 cm樣方的植被群落特征并采集樣方內草地植物地上生物量和0－10 cm及10－20 cm地下生物量，樣品帶回室內，在烘箱內以80 ℃烘干至恒重并計算生物量。另用直徑 3.5 cm的土鉆以蛇形取樣法在每個小區內分別采集 5－8鉆0－10 cm、10－20 cm的土樣分層混合均勻，去除其中的石粒、植物凋落物和根系等，以冰盒取回實驗室于 4 ℃冰箱保存用于土壤微生物 Biolog培養實驗。

土壤微生物群落多樣性采用 Biolog-ECO法測定，稱取10 g鮮土于250 mL三角瓶中，加入90 mL 0.85% NaCl溶液，25 ℃下 200 r·min-1震蕩 30 min，取上清液加入到 9 mL NaCl溶液，等比例稀釋至1∶1000。向ECO微平板每孔中加入150 μL稀釋液，接種好的Biolog-ECO板于25 ℃黑暗環境下培養8 d，每隔24 h在Biolog微平板讀數儀上測其吸光度（宋收等，2016；鄭麗萍等，2013）。

1.3 數據處理

（1）植物物種重要值（Pi）（尹亞麗等，2017）：

（2）植物物種豐富度指數（S指數）：

其中，N為每個樣地的物種總數（尹亞麗等，2019）；

（3）植物Simpson優勢度指數（D指數），反映群落中最常見的物種：

表1 樣地基本情況Table 1 Basic conditions of sampling sites

式中，Pi為物種i的重要值（董乙強等，2018）；

（4）植物及土壤微生物Shannon-Wiener多樣性指數（H指數）：

式中，Pi為物種i的重要值或ECO板上第i孔吸光值/所有吸光值之和；

（5）植物Pielou均勻度指數（E指數），用來衡量群落均一性程度：

式中，H為植物多樣性指數，S為植物物種豐富度指數；

（6）平均每孔顏色變化率（Average well color development，AWCD）是反映土壤微生物碳源利用能力、土壤微生物活性和多樣性大小的一個重要指標：

式中：Ci為第i碳源孔590 nm和750 nm兩波段光密度差值，R為對照孔光密度值，31為 ECO板供試碳源的種類數。

（7）碳源相對利用率：培養第3天的某一類碳源類型 AWCD之和/31種碳源的 AWCD之和×100%。根據化學基團的性質將 Biolog-ECO板上的31種碳源分成6大類，即糖類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類及酸類。

圖表中數據為平均值±標準差，采用Excel 2010整理數據，利用 SPSS 25.0進行統計分析，采用CANOCO 4.5軟件對土壤微生物AWCD進行趨勢對應分析（DCA），采用 R3.4.3軟件對數據進行Pathway富集分析、相似性分析（Ananlysis of similarities，Anosim）和冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。采用單因素（One-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（α=0.05）。利用Excel 2010和SigmaPlot 10.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同地區黑土灘退化草地植被特征

在YNG、DW和BT黑土灘退化草地共鑒定、分類草地植物51種（表2），不同地區間植物物種組成差異較大。3個地區黑土灘退化草地植物共有種有5種，分別是：垂穗披堿草（Elymus nutans）、細葉亞菊、矮火絨草（Leontopodium nanum）、冷蒿和肉果草（Lancea tibetica），菊科植物占優勢。特有種在野牛溝有6種，大武有14種，巴塘有9種。物種重要值大于5的植物在野牛溝有細葉亞菊、直立梗唐松草（Thalictrum alpinum var. elatum）、白花梔子花（Dracocephalum heterophyllum）和裂葉獨活（Heracleum millefolium），其物種重要值分別為19.15、7.60、6.49和5.90；大武有冷蒿、臭蒿、巖生忍冬（Lonicera rupicola），其物種重要值分別為25.31、15.66和8.54；巴塘有冷蒿、細葉亞菊、肉果草、白苞筋骨草（Ajuga lupulina），其物種重要值分別為26.07、11.67、8.52和6.08。3個地區黑土灘退化草地中莎草科和禾本科等優良牧草物種重要值均較小，成為群落的偶見種，而毒雜草比例較高，在畜牧業生產中已基本無利用價值。

表2 不同地區黑土灘退化草地物種組成及其重要值Table 2 Plant composition and importance value of black soil beach degraded grassland in different regions

不同地區黑土灘退化草地植物物種多樣性存在差異，其中，大武草地植物物種豐富度最大，野牛溝次之，巴塘最小，分別由 16，12，11種植物組成，大武和巴塘草地植物物種豐富度差異顯著（P＜0.05）（表3）。植被優勢度指數、多樣性指數和均勻度指數均為野牛溝＞大武＞巴塘。野牛溝黑土灘退化草地植物多樣性顯著高于巴塘（P＜0.05），其植被均勻度指數顯著大于大武和巴塘（P＜0.05）。在0－10 cm土層，各地區地下生物量間差異顯著（P＜0.05），其中，大武草地地下生物量最大，野牛溝地下生物量最小；在10－20 cm土層，大武和巴塘地下生物量顯著高于野牛溝（P＜0.05）。各地區草地植物地上生物量差異達顯著水平（P＜0.05），大武最大，巴塘次之，野牛溝最小。

2.2 不同地區黑土灘退化草地土壤微生物群落組成特征

不同地區黑土灘退化草地土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）和H指數隨培養時間的延長不斷升高（圖1），均在第1－5天迅速增加，第5天后增速減緩。對培養第 3 d（田雅楠等，2011）的土壤微生物AWCD和H指數進行方差分析，結果表明（圖2），在0－10 cm土層，大武和巴塘地區土壤微生物H指數顯著高于野牛溝地區（P＜0.05）；在10－20 cm土層，大武地區土壤微生物AWCD顯著高于野牛溝地區（P＜0.05），各地區土壤微生物H指數差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同地區黑土灘退化草地植被特征Table 3 Vegetation characteristics of black soil beach degraded grassland in different regions

2.3 不同地區黑土灘退化草地土壤微生物群落功能特征

圖1 不同地區黑土灘退化草地土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）和Shannon-Weiner指數（H）Fig. 1 Soil microbial AWCD and Shannon-Weiner index (H) of black soil beach degraded grassland in different regions

圖2 培養第3天不同地區黑土灘退化草地土壤微生物AWCD和H指數Fig. 2 AWCD and H index of soil microorganisms of black soil beach degraded grassland in different regions on the third day of cultivation

圖3 不同地區黑土灘退化草地土壤微生物對6類碳源相對利用率Fig. 3 The relative utilization rates of 6 groups of carbon sources by soil microorganisms of black soil beach degraded grassland in different regions

黑土灘退化草地土壤微生物對六大類碳源相對利用率結果表明（圖3），在0－10 cm土層，黑土灘退化草地土壤微生物對氨基酸類、酯類和胺類碳源的相對利用率均顯著高于糖類、醇類和酸類（P＜0.05），碳源相對利用率均在19%以上；在10－20 cm土層，黑土灘退化草地土壤微生物對氨基酸類和酯類碳源的相對利用率均顯著高于糖類、醇類、胺類和酸類（P＜0.05），碳源相對利用率均在22%以上。即黑土灘退化草地土壤微生物在 0－10 cm土層主要利用氨基酸類、酯類和胺類碳源，在10－20 cm土層主要利用氨基酸類和酯類碳源。不同地區黑土灘土壤微生物對六大類碳源的相對利用率在不同土層變化趨勢不同，在0－10 cm土層，各地區間差異不顯著；在10－20 cm土層，野牛溝和大武、巴塘的酸類和氨基酸類碳源相對利用率差異均達顯著水平（P＜0.05），野牛溝地區的醇類碳源相對利用率顯著大于大武地區（P＜0.05）。

利用R 3.4.3軟件對黑土灘退化草地不同土層土壤微生物群落功能結構進行富集分析和相似性分析，結果顯示（圖4），在0－10 cm和10－20 cm土層，黑土灘退化草地利用A3、A4、B3、B4、D2、D4和 E2等碳源的功能微生物顯著富集，而利用C2、C3、E4、G3和H1等碳源的功能微生物顯著分異，且不同地區黑土灘土壤微生物群落功能結構均存在小的差異（R=0.375，P=0.012；R=0.3426，P=0.005）。對不同地區黑土灘退化草地土壤微生物單一碳源利用能力進行進一步方差分析，結果顯示，在0－10 cm土層，差異來源于酸類（5種：B3、C3、D3、E3、H3）、氨基酸類（2種：D4、E4）、酯類（2種：C1、A3）和糖類（1種：A2）；在10－20 cm土層，差異來源于酸類（5種：B3、F2、C3、E3、F3）、氨基酸類（3種：A4、B4、E4）、醇類（2種：C2、D2）、酯類（1種：A3）、糖類（1種：G1）和胺類（1種：G4）。

圖4 不同地區黑土灘退化草地土壤微生物群落富集分析氣泡圖Fig. 4 Pathway analysis of soil microbial communities of black soil beach degraded grassland in different regions

2.4 黑土灘退化草地植被與土壤微生物群落特征相關性分析

在0－10 cm土層，土壤微生物AWCD與植物優勢度指數呈顯著負相關關系（P＜0.05），與多樣性指數和均勻度指數均呈極顯著負相關關系（P＜0.01）（表 4）；土壤微生物 H指數與地上生物量呈顯著正相關關系（P＜0.05），與0－10 cm地下生物量呈極顯著正相關關系（P＜0.01），與植被均勻度指數呈極顯著負相關關系（P＜0.01）。在10－20 cm土層，土壤微生物AWCD與地上和地下生物量均呈顯著正相關關系（P＜0.05），土壤微生物H指數與10－20 cm土層地下生物量呈顯著正相關關系（P＜0.05），與地上生物量及 0－10 cm土層地下生物量呈極顯著正相關關系（P＜0.01）。即土壤微生物AWCD在0－10 cm土層與植被多樣性相關性較高，在10－20 cm土層與植被生物量的相關性較高；土壤微生物H指數在0－10 cm土層與植被生物量及均勻度指數相關性較高，在10－20 cm土層與植被生物量相關性較高。

表4 土壤微生物AWCD和H指數與植被特征的相關性系數Table 4 Correlation coefficient between AWCD and H index of soil microorganisms and vegetation characteristics

2.5 黑土灘退化草地植被特征與土壤微生物群落組成的冗余分析

利用CANOCO 4.5軟件對土壤微生物AWCD進行DCA分析，對不同碳源進行分組和排序，計算其第一排序軸的梯度范圍，梯度范圍數值小于3.0，采用RDA分析；在3.0－4.0之間，采用RDA分析和典型相關分析（CCA）均可；大于 4.0，采用CCA分析（李海云等，2018）。本試驗DCA分析梯度范圍數值小于3.0，用R 3.4.3對土壤微生物群落與植被特征間的相互關系進行了冗余分析，結果顯示，植物生物量（地上及地下）、多樣性（均勻度、多樣性、豐富度和優勢度指數）及重要值等變量組可以解釋微生物AWCD組變化的100%，三者共同能解釋88.42%的土壤微生物AWCD的變化，多樣性指數、生物量、重要值的解釋率分別為0%，0%和2.4%，生物量與重要值的共同解釋率為4.03%，多樣性和重要值共同的解釋率為5.15%（圖5）。

3 討論

本研究自3個地區黑土灘草地共調查發現草地植物 51種，莎草科和禾本科優良牧草物種重要值較小，成為群落的偶見種，菊科毒雜草比例較高；草地物種組成及地上生物量均存在明顯地域差異。黑土灘退化草地是極度退化的高寒草甸，其優良牧草比例顯著降低，草地毒雜草化。植被的退化是土壤退化的直接原因，而土壤退化也必然引起植被退化，二者互為因果（周華坤等，2012）。不同經緯度的水熱組合不同可能是導致3個地區黑土灘退化草地植被物種組成、特征指數及生物量有較大差異的原因之一。此外，3個地區黑土灘退化草地土壤碳、氮、磷等元素含量存在差異，這可能也是導致3個地區黑土灘退化草地植被群落差異的主要原因之一，但這一推測還有待進一步證實。

圖5 土壤微生物群落代謝與植被特征的冗余分析Fig. 5 Redundancy analysis (RDA) on soil microbial community constrained by characteristics of vegetation

黑土灘退化草地是高寒草甸極度退化的結果，其土壤微生物AWCD顯著小于未退化高寒草甸（尹亞麗等，2017），李飛等（2018）研究指出，隨著草甸不斷退化，土壤微生物活性逐漸降低，退化對土壤微生物碳代謝功能多樣性造成顯著影響。不同地區黑土灘退化草地土壤微生物群落特征存在差異。土壤微生物群落特征受諸多因素的影響，如氣候、土壤理化性質、植被類型及植物生物量等。冗余分析及相關性分析表明，植被特征對不同地區黑土灘退化草地土壤微生物群落組成特征影響較大。植被可以通過調節土壤溫度、含水量、pH及通氣性等因素從而改變土壤微生物群落的組成和結構（單金峰，2014）。植被均勻度對土壤微生物群落結構有顯著和直接的影響，本研究中，隨植被均勻度增加，土壤微生物活性和多樣性下降，這與Lamb et al.（2011）的研究結果不一致，其原因可能是因研究的草地類型不同而致，Lamb et al.（2011）的研究對象是糙羊茅草原植物，而本試驗的研究對象是極度退化的矮嵩草高寒草甸；此外其研究是在室內栽培環境下開展的土壤微生物研究，這勢必會影響土壤微生物生存的微環境，由此導致研究結果的差異。植物多樣性能改變土壤微生物群落組成（Steinauer et al.，2015），草地地上、地下環境的改變也可以造成草地土壤微生物群落多樣性的差異（趙輕舟等，2018）。有研究表明，微生物群落多樣性隨植被群落結構多樣性的增加而增加（李飛等，2018；Kowalchuk et al.，2002），高生產力的植被類型具有高的土壤微生物多樣性（Zak et al.，2003）。褚海燕（2013）利用高通量測序研究青藏高原土壤微生物的生物地理分布，發現青藏高原土壤細菌多樣性與植物多樣性呈顯著正相關，土壤細菌群落組成、空間分布與植被類型極為相關，空間距離對土壤細菌空間分布有顯著貢獻。本研究結果顯示，植被多樣性指數高的野牛溝地區的土壤微生物多樣性指數較低，這與以往的研究結果不一致，認為野牛溝地區雖然植被多樣性指數高，但是其地上和地下生物量低，可能是導致其微生物多樣性降低的主要原因。Jing et al.（2015）的研究結果也表明，高寒草地細菌多樣性與植物地下生物量呈顯著正相關，為本研究結果提供了進一步支持。此外，土壤總碳和全氮含量對土壤微生物多樣性貢獻較大，是土壤微生物群落功能多樣性差異的主要影響因子（李秀清等，2019）。本研究團隊測定結果顯示不同地區黑土灘退化草地土壤養分含量不同，這可能是導致不同地區黑土灘退化草地土壤微生物群落組成特征另一主要原因。

土壤微生物能將土壤中的多糖、蛋白質、脂肪等大分子營養物質分解成單糖、氨基酸、脂肪酸等小分子物質（尹亞麗等，2018）。本研究中的黑土灘退化草地土壤微生物群落功能特征具有明顯的垂直分布規律，在0－10 cm土層，土壤微生物主要利用氨基酸、酯類和胺類碳源；在10－20 cm土層，主要利用氨基酸和酯類碳源。微生物的活動與植物根系生物量及有機質含量分布有關（姚拓等，2005），上層土壤地下生物量高于下層土壤，且 3個地區黑土灘退化草地植物重要值大于5的植物根系主要分布在0－10 cm土層，這可能是導致上下土層間碳源利用差異的主要原因。不同地區黑土灘退化草地土壤微生物對碳源的利用存在差異，植物功能類群的不同會導致草地微生物功能類群表現出差異（Strecker et al.，2015），不同地區黑土灘退化草地植物群落結構不同，其返回土壤的植物凋落物的質量和數量以及植物根系也存在差異，由此導致不同地區黑土灘退化草地的土壤微生物群落功能差異。裂葉獨活僅在野牛溝地區有分布，且重要值較高，其根長約20 cm，這可能是導致在10－20 cm土層，野牛溝地區黑土灘退化草地土壤微生物對酸類和氨基酸類碳源相對利用率顯著高于和大武和巴塘地區的原因。植物根系分泌物能為土壤微生物提供必要的碳源，植物通過調節根系分泌物對土壤微生物進行調控，以便從土壤中吸取更多的營養物質，滿足自身生長需要。但不同植物的根系分泌物種類和數量存在一定的差異，根系發達的植物根際土壤中根系分泌物和脫落物的種類和數量更多（陳悅等，2018），根系分泌物能改變植株周圍的土壤微環境，并對土壤微生物產生不同的生態效應，從而影響了微生物的數量和區系組成（譚紅妍等，2014；趙吉等，1999），進而影響微生物群落功能多樣性。郭靜（2015）研究認為土壤微生物對6種碳源的利用率與土壤有機質含量呈極顯著相關，土壤微生物對碳水化合物利用率與土壤含水率呈顯著正相關，本試驗3個地區黑土灘退化草地的土壤養分含量與含水量有所不同，這可能也是3個地區土壤微生物群落功能存在差異的原因之一。

富集分析結果顯示，黑土灘退化草地土壤微生物對碳源的利用出現了顯著的富集和分異。黑土灘退化草地是高寒草甸草場嚴重退化的產物，草地毒雜草化。退化草地的群落優勢種和伴生種多被發現具有化感作用，如乳白香青，冷蒿，黃帚橐吾，細葉亞菊，甘肅馬先蒿，白苞筋骨草，露蕊烏頭，披針葉黃華等（平曉燕等，2018；任元丁等，2014）。雖然本研究并未直接測定 31種碳源中哪些碳源屬于化感自毒物質，但已有研究證實2-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲酸是重要的化感自毒物質（董艷等，2013），本研究中，3個地區黑土灘退化草地土壤微生物對4-羥基苯甲酸的利用率較大，可認為其是土壤微生物適應這種有化感自毒的物質，并能夠利用化感物質來滿足自生的生長需要，適應退化草地的土壤微環境。

4 結論

黑土灘退化草地植被毒雜草化，優良牧草比例極低，不同地區黑土灘退化草地植被群落組成和土壤微生物群落組成存在差異。植被均勻度指數、多樣性指數、優勢度指數及生物量對土壤微生物群落組成特征有較大影響。不同土層黑土灘退化草地主要利用的碳源類型不同，在0－10 cm土層，黑土灘退化草地土壤微生物主要利用氨基酸、酯類和胺類碳源；在10－20 cm土層，主要利用氨基酸和酯類碳源。黑土灘退化草地土壤微生物對碳源的利用出現顯著富集和分異。不同地區的黑土灘退化草地土壤微生物對碳源的利用存在差異，在 0－10 cm土層，差異主要表現在酸類、氨基酸類和酯類，在10－20 cm土層，差異主要表現在酸類、氨基酸類和醇類。土壤微生物 AWCD與植被均勻度指數呈極顯著負相關關系，土壤微生物H指數與植被生物量呈顯著正相關關系。88.42%的土壤微生物AWCD變化是由草地植物生物量、多樣性及重要值三者共同解釋的。