晉東南3種道地藥材植物根際真菌群落特性

李毳，劉怡

山西財經大學資源環境學院，山西 太原 030006

微生物群落的結構、功能和多樣性受多種因素的影響，目前尚無一致的結論（柴永福等，2016）。研究表明環境選擇和擴散限制是影響微生物群落構建的兩個重要方面，二者相對作用的大小因生物屬性、生境和研究尺度不同而存在差異（牛克昌等，2009）。植物根際土壤中生長著大量各種類型的微生物，包括細菌、真菌、放線菌等（厲桂香等，2018）。植物和土壤因子對根際微生物群落的結構和多樣性具有重要的影響。根系分泌物介導了植物根際微生態系統的物質和能量驅動微生物趨化過程，形成了植物所特有的根系核心微生物區系（Bulgarelli et al.，2012）。根系分泌物影響根際微生物的種類和數量，并對微生物的生長繁殖及代謝過程產生影響（Singh et al.，2004），植物通過根際“主動”選擇土壤微生物，盡管不能確定是否選擇了有益的微生物（Chaudhary et al.，2016），但這些微生物通過促進植物對礦質營養物質的吸收、改善土壤的理化性質，從而促進植物生長（Bais et al.，2004）。中藥材植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge）、地黃（Rehmannia glutinosa）等的酸性根系分泌物可以誘導厚垣孢子、卵孢子和菌核的萌發，影響土壤微生物的群落組成，細菌數量減少，真菌數量增加（嚴鑄云等，2012）。有多項研究表明，藥用植物能夠顯著影響其根際微生物種群的組成（Berendsen et al.，2012），長期種植地黃能夠顯著改變土壤微生物群落的結構和多樣性（吳林坤等，2015）。Glassman et al.（2017）的研究發現pH和土壤營養在局域尺度上驅動真菌的群落的構建，真菌群落結構和土壤理化性質顯著正相關。在研究植物群落構建的驅動力時，植物-微生物-土壤之間的相互作用很容易被忽視（Thompson et al.，2001），土壤理化因子與植物類型是否相互作用，影響土壤微生物多樣性還有待深入研究。

山西地形復雜，晉東南太行山區是傳統中藥材產區，中藥材資源豐富且歷史悠久，大宗中藥材道地品種連翹（Forsythia suspensa）、遠志（Polygala tenuifolia Willd）、黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）、黃芪（Astragalus membranaceus Fisch）、柴胡（Bupleurum chinese）、黨參（Codonopsis piloula）等都在全國形成規模。本研究中選取遠志、柴胡、黨參3種野生道地藥材為研究對象，小尺度局域空間上探討 3種藥材根際土壤真菌群落多樣性、結構及其驅動因素。

1 研究區域與研究方法

1.1樣品采集

2018年5月，在山西省長治市武鄉縣石圪垤村（36°44′N，113°60′E）附近溝坡，選取地表植被基本均勻的樣地，選擇長勢、株齡（5年左右）相近的野生遠志、柴胡和黨參各3株，共收集到9個樣品的根際土壤。具體方法參照Riley et al.（1969，1970）的抖落法：挖取具有完整根系的土體，輕輕抖落大塊不含根系的土壤，然后用力將根系表面附著的土壤全部抖落下來，混合后，密封于無菌塑料袋，置于車載冰箱保存，并盡快帶回實驗室。仔細去除新鮮土樣中可見的植物殘體及土壤動物等，將土樣分為兩份，一份風干處理，用于土壤理化性質的測定，一份提取土壤微生物基因組DNA，用于高通量測序。

1.2土壤理化性質測定

土壤含水量用烘干法測定；土壤pH值用電位法HANNA HI3221測定（土水質量比1∶2.5）；土壤全碳（TC）、全氮（TN）、全硫（TS）用元素分析儀（vario MACRO cube，Germany）測定；土壤硝態氮（NO3--N）、亞硝態氮（NO2--N）、銨態氮（NH4+-N）用CleverChem 380間斷元素分析儀測定；土壤粒度用粒度儀（Mastersizer 3000，Malvern，UK）測定，上機前對土壤進行前處理去除碳酸鹽和有機質。

脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，其活性以37 ℃下培養24 h 后1 g土壤產生的NH3+-N的mg數表示；蔗糖酶采用3, 5-二硝基水楊酸比色法，其活性以37 ℃培養24 h 后1 g土壤產生的葡萄糖的mg數表示；過氧化氫酶活性采用KMnO4滴定法，其活性以20 min內每克土壤分解的過氧化氫的mg數表示。

1.3土壤真菌群落分析

每種藥材的土壤取3個樣品，每個樣品分別稱取5 g，將鮮土樣送至北京百邁客生物科技有限公司進行高通量測序。基于Illumina HiSeq測序平臺，利用引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2-Rev（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）對核糖體ITSⅠ高變區進行測序。

1.4數據分析

各樣地土壤理化變量之間的顯著性差異（P＜0.05）均采用單因素方差分析（SPSS 23.0 One-way analysis）和多重比較分析。使用FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對每個樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列即原始 Tags數據（Raw Tags）；使用Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的 Raw Tags進行過濾，得到高質量的 Tags數據（Clean Tags）；使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數據（Effective Tags），使用QIIME（version 1.8.0）軟件中的UCLUST[2]對 Tags在 97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU。使用Mothur（version v.1.30）軟件，計算樣品的Alpha多樣性指數，包括反映微生物多樣性的Shannon指數、Simpson指數，群落豐富度指數Chao1指數和 ACE指數以及反映測序深度的Coverage指數。

2 結果與分析

2.1土壤理化性質

土壤pH、TC、TS、土壤粒度、脲酶和蔗糖酶活性在3種不同植物的根際土間差異顯著，而土壤含水率、TN、NO3--N、NH4+-N、NO2--N、過氧化氫酶活性的差異不顯著（表 1）。所有土壤樣品的pH都大于7，為弱堿性土壤。黨參根際土的pH值最大（7.80）。TN、TC、TS在柴胡根際土中均為最大。土壤脲酶和蔗糖酶在樣品間差異顯著，柴胡根際土中的脲酶活性最高（6.54），蔗糖酶活性最低（8.64），黨參根際土中脲酶活性最低（0.55），蔗糖酶活性最高（11.40）。

2.2 3種藥材根際土壤真菌群落組成及其多樣性

圖1 不同植物根際真菌群落在門（a）和屬（b）水平的相對豐度及聚類分析（c）Fig. 1 The relative abundance of dominant fungal phylum (a) and genus(b), and cluster analysis(c) from rhizosphere of three plants

3種藥用植物的9個根際土壤樣品中共鑒定出9個真菌門和143個真菌屬，真菌群落分布格局具有一定規律性（圖1a），子囊菌門Ascomycota和擔子菌門 Basidiomycota相對豐度最大，黨參根際土壤中，擔子菌門的相對豐度顯著大于遠志和柴胡，而子囊菌門的相對豐度顯著小于遠志和柴胡。從9個樣品根際土壤群落中，共鑒定出相對豐度大于1%的優勢真菌屬有9個，其中，絲蓋傘屬Inocybe（39.89%）、白環蘑屬Leucoagaricus（7.05%）在黨參根際真菌群落中占據顯著優勢；被孢霉屬Mortierella（3.39%、8.34%、3.96%）分別在遠志、黨參和柴胡根際中均占有顯著優勢；Ramicandelaber屬（1.02%，3.79%）、Paraphoma屬（1.98%、1.60%）分別在遠志和柴胡根際真菌群落中優勢較大；Naganishia屬（4.77%）在遠志根際群落中優勢較大；Tetracladium屬（1.05%、2.64%）在黨參和柴胡根際土中優勢較大；Ceratobasidium屬（1.96%）在柴胡根際土中優勢較大（圖1b）。根際真菌屬水平豐度熱圖分析結果顯示（圖1c），遠志、柴胡和黨參根際真菌群落結構差異顯著，黨參與遠志、柴胡差異更大。

3種藥材植物根際土壤真菌群落α多樣性分析結果見表2。其中柴胡根際真菌群落Shannon指數最大，Simpson指數最小，因此，柴胡根際真菌群落多樣性最高，而均勻度較低。黨參的Shannon指數最小，Simpson指數最大，說明黨參根際真菌群落的多樣性較低，而均勻度較高。遠志的 ACE指數和Chao1指數最大，表明其根際真菌群落中種類數目最多；黨參根際真菌群落的ACE和Chao1指數最低。

表2 3種藥材根際土壤真菌群落多樣性Table 2 Diversity of fungal communities of three species rhizosphere

2.3環境因子對土壤真菌群落α多樣性的影響

土壤環境因子和α多樣性指數間的相關分析結果表明（圖2），根際真菌群落Simpson指數與根際土壤pH、蔗糖酶呈顯著負相關；Shannon指數與pH、蔗糖酶呈顯著負相關，與TN、TS和脲酶呈顯著正相關性。說明3種植物根際真菌群落的多樣性與土壤環境因子密切相關。

2.4環境因子與植物類型對土壤真菌群落的關系

NMDS分析結果表明3種藥用植物根際土壤真菌群落組成差異顯著（P＜0.05）（圖3a）。為了探究3種植物根際土壤真菌群落差異的驅動因素，對本研究區土壤中的優勢真菌屬豐度和土壤理化因子、植物類型進行冗余分析（圖 3b），結果表明RDA1和RDA2分別解釋3種植物根際土壤真菌群落差異的44.41%和20.54%，其中土壤pH、蔗糖酶、脲酶、全氮對真菌群落結構影響顯著，且土壤 pH是解釋度最高的環境因子。

在植物分類學上，3種藥用植物分屬于遠志科（Polygalaceae）、傘形科（Umbelliferae）和桔梗科（Campanulaceae），植物的生理生態特征具有一定的差異。方差分解分析植物在科水平上的差異與土壤因子對植物根際微生物群落影響的相對大小（圖4），結果顯示土壤、植物種類分別解釋了3種植物根際真菌群落差異的32%和27%，環境因子和植物類型的交互作用對其解釋為6%。表明土壤環境因子和植物類型對根際真菌群落均具有顯著的影響。

圖2 α多樣性指數與土壤環境因子相關性矩陣圖Fig. 2 Correlation matrix diagram among α-diversity index and edaphic factors

圖3 優勢真菌屬的NMDS分析及其與土壤環境因子和植物類型的冗余分析Fig. 3 NMDS analysis of dominant fungi genus (a) and RDA analysis of dominant fungi genus constrained by edaphic factor (b)

圖4 方差分解分析土壤環境因子和植物類型對真菌群落影響相對大小Fig. 4 Variation partitioning analysis showing the percentages of variance in fungal communities explained by soil environment factor and medicine plant type

3 討論

3.1土壤環境因子對植物根際真菌群落的影響

微生物作為土壤地球物質化學循環的主要參與者，其群落結構和功能受到土壤環境因子的影響。環境因子和擴散限制對于微生物群落結構和多樣性的影響作用的相對大小，因微生物屬性（細菌、真菌、原生動物）、生境類型、研究尺度的不同而不同。就環境因子而言，不同的土壤因子（pH、鹽度、溫度、濕度、土壤酶等）與微生物群落結構和多樣性的關系不盡一致。Burns et al.（2015）在美國博德加灣附近研究了 14種不同植被類型的土壤微生物群落多樣性，發現在局域尺度下，植物種、土壤化學特征和空間因素對土壤真菌和細菌群落的多樣性均具有顯著的影響。對華北落葉松林土壤真菌群落結構的研究顯示，土壤理化因子和地上植被多樣性對真菌群落結構和多樣性具有顯著影響，而且在測定的 10種土壤因子中，不同的真菌門與各種土壤理化因子（銨態氮、硝態氮和鹽度）的相關性存在差異（趙鵬宇等，2018）。王淼等（2013）在罕山通過研究不同林型下土壤微生物特性時，發現土壤有機質和土壤含水率對真菌群落結構和代謝多樣性的貢獻率很高。Cox et al.（2010）的研究表明生態系統中真菌群落的分布與土壤氮的含量密切相關。本研究在微尺度上分析了3種藥用植物根際真菌群落的結構，結果顯示土壤 TN、pH、脲酶及蔗糖酶對真菌群落有顯著影響。本研究中植物根際子囊菌門和擔子菌門相對豐度較高，它們不僅是土壤真菌群落中有機質的主要分解者（Yelle et al.，2010），而且二者與植物共生形成菌根，參與根際氮素的循環，對植物的生長發育具有重要作用。許多研究結果都表明，土壤菌根菌（叢枝菌根真菌、外生菌根菌）與土壤pH的顯著相關（Kluber et al.，2012），與本研究結果一致。

3.2植物物種類型與根際土壤微生物的相關性

植物類型對根際土壤微生物群落的“選擇”主要是通過植物根系分泌物來實現的（Singh et al.，2004），特別是菌根真菌類等與植物共生的微生物，是根際微生物群落的主要組成物種。根系分泌物是植物與土壤進行物質交換和信息傳遞的重要載體物質，是植物響應外界脅迫的重要途徑，也是構成不同植物微生態結構的關鍵因素（Bais et al.，2006）。根系分泌物為微生物提供碳源，驅動土壤微生物營養循環（N、S、P）過程（劉純等，2013）。根系分泌物的種類和數量決定了根際微生物的多樣性和豐度，并對微生物的生長繁殖及代謝過程產生影響（袁秀梅等，2016；Hu et al.，2018）。藥用植物根際分泌物中豐富的糖類、氨基酸及維生素等對土壤微生物的種類、數量及植物根際的分布具有顯著的影響（Chaudhary et al.，2016）。不同藥用植物可以通過根系分泌物作用于根圍環境，產生根際效應，影響根際土壤微生物的群落多樣性和結構。

在本研究中，土壤環境因子和植物是植物根際真菌群落結構和多樣性的主要驅動因子，土壤-植物-微生物相互作用，土壤為植物和微生物提供載體和礦質營養，植物為土壤提供碳源和有機質，微生物驅動碳、氮、硫、磷等物質化學循環過程。土壤、植物、微生物相互作用，形成特定的土壤生態系統，為“道地”藥材的生長提供了特異的生境。道地藥材的形成有其歷史條件、地理條件和生長的環境因子，“道”的形成就是不同的藥材基因型和環境因子互相作用的產物。山西太行山地區自古以來就是黨參、柴胡以及遠志的重要產區，野生黨參、柴胡、遠志的生長也表明環境因子起到了重要的作用。

4結論

柴胡、黨參和遠志3種野生道地藥材根際真菌群落主要受土壤環境因子和植物類型的影響，且土壤環境因子是根際土壤微生物群落結構和多樣性的主要驅動因素，同時，植物類型也發揮重要作用，體現了植物-土壤-微生物在土壤生態系統中的協同關系，為道地中藥材的生長提供了特定的生境。